病原细菌的分离与鉴定Word格式文档下载.doc

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②局部感染→病患部位；

③特殊病例→特殊处理。

特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。

无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织

（2）病料的采集时间也应特别注意：

①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化；

②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。

2．无菌操作

无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。

无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。

不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。

无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：

病料的采集、器材的准备、具体的操作。

所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。

3．培养基

培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。

（1）制作培养基的基本原则

依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。

（2）制作培养基的基本要求

①适宜的水分和各种营养物质；

②适宜的酸碱度与渗透压；

③不含抑制细菌生长的物质；

④应均质透明；

⑤应彻底灭菌；

⑥对某些微生物必须提供一些特殊物质。

（3）培养基的种类

①基础培养基：

含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；

可作为一些特殊培养基的基础成分。

②加富培养基：

在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；

用以培养对营养要求高的微生物。

③选择培养基：

利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；

在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。

④鉴别培养基：

是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。

某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；

从而达到区分不同的微生物。

⑤厌氧培养基：

利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；

可用于厌氧性细菌的分离和培养。

4．细菌在培养基上的生长情况

（1）固体培养基

单个细菌在培养基表面生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群落称为菌落，它是由数以万计相同的细菌集合而成。

众多细菌在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体称为菌苔。

①菌落的形态特征

大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。

据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：

光滑型菌落（S型菌落）：

菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。

粗糙型菌落（R型菌落）：

菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。

R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。

R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。

但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。

粘液型菌落（M型菌落）：

菌落粘稠、有光泽、似水珠样。

多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。

②菌落溶血特征

α溶血：

又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；

β溶血：

又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；

γ溶血：

即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。

③色素

有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。

④气味

某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。

（2）液体培养基

细菌在液体培养基中有3种生长现象：

大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；

少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；

枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。

（3）半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。

无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

5．分离细菌所要满足的培养条件

（1）适宜的培养基条件；

（2）适宜的温度条件；

（3）适宜的气体条件。

三、细菌的分离方法

细菌分离就是把病料中的病原菌或把目的菌从微生物的混合材料中分离培养出来，并获得目的菌的单一生长材料，从而进行诊断及有关研究工作。

1．待检材料的处理

无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；

污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。

（1）加热处理法

当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨（液体病料除外），75℃水浴30min（或80℃15-20min），可杀死细菌繁殖体（包括杂菌及病原菌）；

然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。

（2）接种易感动物

把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。

利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。

（3）化学药品处理

有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。

因此可将适宜的化学药品加入培养基中。

如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；

2．平板划线分离培养法

（1）培养基平板的准备

取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。

（2）各种物品的准备

取出待检病料，置于工作台上；

接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。

如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。

不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。

（3）平板划线

以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。

右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。

把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。

将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；

再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。

（4）培养物的观察

病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。

首先用肉眼检查有无细菌生长；

若有，则需进一步检查菌落是否纯一。

当从临床病料中分离细菌时：

多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；

少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。

为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。

3．厌氧菌的分离培养法

通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：

厌氧培养箱、厌氧肉汤

4．细菌的纯培养与移植接种

分离培养的目的就是要获得纯培养。

细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯培养是一个细菌的后代。

细菌的移植接种就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。

四、细菌的培养技术

根据目的和要求的差异，可采取不同的培养方法

1、表面培养

又称固体表面培养。

将细菌液均匀地接种于固体培养基表面,平放静置培养，然后收集菌苔。

2、深层培养

将细菌液接种于液体培养基进行培养。

包括液体静置深层培养和生物反应器（发酵罐）深层培养。

3、透析培养

根据小分子能透过半透膜扩散，而将不同分子量的物质分离原理设计的一种细菌培养装置进行细菌培养。

五、细菌的生化试验

细菌由于其种类不同，对营养物质的吸收与排出，分解与合成的能力不同，这与细菌本身所固有的和环境诱导的酶有密切关系，细菌在自然界是一种巨大的生化动力，在它们的代谢过程中往往同时产生多种代谢产物，有些对人类有利，有些会引起动植物和人类疾病，细菌的这些合成和分解代谢产物具有种的特异性，我们可借此来进行细菌种的鉴定。

1、氧化型与发酵型（O/F）的测定

（1）原理

不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。

这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。

（2）培养基

成分：

蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香草酚蓝（BTB）12mL，蒸馏水1000mL

制法：

将蛋白胨、琼脂、盐类和水混合，加热融解，调pH为7.2，然后加葡萄糖和指示剂，混合加热10min，分装试管，加塞包装，115℃高压蒸汽灭菌20min，取出使成琼脂柱。

（3）试验方法

①用18-24h斜面培养物接种于两管O/F培养基，穿刺接种，距管底有一定距离。

②加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F试验管作发酵试验

③37℃下孵育48h或更长点时间

（4）结果判定

①只在没有覆盖石蜡油的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型（或呼吸型）

②两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型

2、糖类分解（发酵）试验

（１）原理

细菌分解糖的能力是受遗传基因控制的，是细菌含有直接分解糖的酶或诱导产生的酶作用的结果，是细菌种的特征的表现，可帮助细菌的鉴定，含糖培养基中含有指示剂，若某细菌分解糖则产酸（发酵）或产酸产气（氧化），会使培养基的指示剂改变颜色，可判断细菌是否分解某种糖或醇或其他碳水化合物。

（２）培养基

需氧菌常用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的琼脂＋1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇（见附录）（有市售各种微量发酵管也可用）。

厌氧菌用含胨、盐、硫羟代乙醇酸钠、琼脂的高层半固体培养基半指示剂同上。

①琼脂斜面培养物用接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！

）。

②若所要接种的细菌营养要求