白血病分类中免疫标记技术的应用与意义Word下载.doc

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一．白血病免疫分型基础

白血病的免疫学分型是利用单克隆抗体检测白血病细胞的细胞膜和胞浆抗原,分析其表型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。

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1.白细胞分化抗原

白细胞分化抗原（leukocytedifferentiationantigen）是指血细胞在分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。

20世纪70年代末以来，由于单克隆抗体与流式细胞仪的发展，1982年国际上统一使用分化群（clusterofdifferentiation，CD）作为白细胞分化抗原和相应McAb的命名，至今已命名了CD1-CD166。

2．T细胞及其亚群

T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、CD7+，未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。

在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。

但在正常外周血中通常存在CD3+、CD4+、CD8-，CD3+、CD4-、CD8+，CD3+、CD4+、CD8+和CD3+、CD4-、CD8-四种表型不同的T细胞，它们分别占T细胞总数的60%-70%，20%-30%，1%-3%，1%-10%。

前三种表型细胞的TCR主要为TCRαβ，而CD4-、CD8-T细胞主要表达TCRγδ，它们都执行细胞免疫功能。

3．B细胞

B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。

B细胞上的CD抗原分为：

①B细胞限制性（特异性）抗原：

CD19、CD20、CD21、CD22、CD77和CD79，它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。

②B细胞相关性抗原：

CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。

而B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。

4．髓系

根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达将其大致分为七种类型：

（1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：

CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。

其中CD13在原粒细胞质中表达比膜上早，在AML诊断上十分重要。

（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有：

CD15和CD65。

（3）以单核细胞为主，但也存在于粒细胞的抗原有：

CD14和CD33。

（4）基本只表达在粒细胞上的抗原有：

CD16b和CD66。

（5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：

CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。

CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志，用CD68单抗可将AML-M1～M3与AML-M4及AML-M5区别开来。

（6）造血干、祖细胞抗原有：

CD34和CD90。

CD34和CD90虽列在髓系抗原中，但都属于造血干、祖细胞抗原。

CD34除表达在早期造血干、祖细胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL上，这些CD34+的白血病细胞可能来自具有多系性分化能力的分化不良的前身细胞。

（7）其他髓系相关抗原：

这些抗原主要存在于其他系细胞上，但在某些髓系细胞上也有表达，如：

CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。

5．巨核细胞系

在巨核细胞系发育过程中依次出现PPO、CD41a（Ⅱb/Ⅲa）、CD41b（Ⅱb）和CD61（Ⅲa）、CD42（Ⅰb），还可表达CD36（强）。

目前研制出的抗血小板单抗，如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。

当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放、整合到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62（P-选择素）、CD63、CD107a和CD107b。

6．干、祖细胞系

CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。

目前CD34已作为能识别人类最早造血干、祖细胞的重要标志。

现知更早期的干细胞为CD34-。

CD34+、CD38-细胞在形态上缺乏分化特点，是更幼稚、能维持长期造血的启动细胞（LTC-IC）。

CD34+、CD38+细胞则大多处于造血祖细胞阶段，可形成各系造血集落，但不能维持长期造血。

故CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一，并随一定的分化过程表达上调。

鉴于CD34抗原可以识别出造血干、祖细胞，结合其它相关分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育阶段的标志。

如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标志；

CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。

而CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向的祖细胞。

最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞标志，故现在人们多把CD34-、CD90+、Lin-细胞视为造血干细胞的重要标志。

二．主要的免疫标记技术

（一）酶免疫组织化学技术

免疫组织化学是利用免疫化学反应来定位组织细胞中特异大分子的一类技术。

免疫组织化学反应原理是把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下可见的标记物标记特异抗体（或者标记抗原抗体复合物），使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。

[3]酶免疫组织化学技术的特点是酶反应产物呈现的颜色可用光学显微镜或电子显微镜观察，标本可长期保存。

具体检测技术有PAP、APAAP、ABC等。

1．PAP法（过氧化物酶－抗过氧化物酶法）

特点：

（1）具有较好的特异性和敏感性；

（2）价格昂贵。

应用：

多用于抗原损失较多的石蜡包埋组织的免疫组织化学检测。

2．APAAP法（碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶法）

（1）灵敏度高；

（2）内源性过氧化物酶不引起干扰、染色效果好；

（3）价格昂贵、操作繁琐。

（1）特别适合涂片细胞的染色，尤其是血液和骨髓标本的白血病分型，国内多用于检测T淋巴细胞表面的分化抗原；

（2）用于蛋白印记法，通过单克隆抗体测定抗原的相对分子质量；

（3）可与免疫过氧化物酶法联合，进行双免疫酶染色。

3．ABC法（生物素－亲和素复合物法）

（1）对细胞表面抗原的检测具有高度敏感性和特异性；

（2）标本可长期保存；

（3）可用于双重或多重免疫染色；

（4）可用于几乎不含活细胞的标本的细胞诊断；

（5）用于周围血涂片时，用姬姆萨溶液复染，可以同时进行分析白细胞；

（6）检测细胞表面抗原时费用少。

常用于检测细胞的免疫分型、诊断白血病的类型，也广泛应用于组织抗原的检测、免疫电镜、凝集素组织化学和原位分子杂交。

[4]

（二）流式细胞术

流式细胞术是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。

[3]

（1）具有良好的准确性、重复性和灵敏度，并能在每个细胞基础上同时测定多个参数；

（2）缺少直接控制和结构信息，不能提供细胞形态学。

（1）细胞样品的检测、核内DNA的检测；

（2）免疫学分选；

（3）分析细胞表面和细胞内的抗原，进行细胞免疫分型，有助于白血病的诊断，用双色流式细胞术进行混合性白血病的鉴别；

[4]（4）临床预测，如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，示预后不好；

（5）疾病监测，可进行微小残留白血病的检测。

（三）荧光原位杂交技术（FISH）

荧光原位杂交技术的原理是将生物素化的高特异性DNA探针与细胞核DNA的特定部位进行原位杂交，然后用FITC标记的生物素与杂交体的生物素结合，最后通过荧光显微镜观察杂交部位的荧光强度。

荧光强度的大小反映DNA杂交的程度。

（2）具有较高的位置分辨率，检测速度较快，探针的稳定性也较好；

（3）同一核酸分子上利用不同颜色的荧光标记探针同时检测2个或2个以上的序列；

（4）安全，无放射性。

可确定鉴别染色体、检测染色体的异常或确定特别序列的染色体位置。

FISH技术已在许多领域显示出重要的作用，包括细胞遗传学、产前诊断、肿瘤生物学、基因扩增和基因定位等。

三．白血病分类中免疫标记技术的应用与意义

应用免疫标记技术对细胞的属性、分化阶段或变异进行鉴别，有助于白血病的诊断和分类。

其特点是特异性强、灵敏性高，并可在原位直接进行定性和半定量的形态学观察，也可进行定量测定和分选，为疾病的诊断和发病机制的研究提供强有力的手段。

1．AML

MO：

其特征为T、B细胞标记的阴性，主要是CD19、CD20、CD22与CD3、CD5、CD7。

虽然现在CD10已不作为B细胞的特异性标记，但CD10也必须阴性。

作为干、祖细胞标记的CD34、CD38和HLA-DR均为阳性，具有特征性的TdT标记应有至少30%的原始细胞会呈阳性表达。

而髓系特征不能过多，通常是CD13、CD33、CD117中的任何一项呈阳性表达；

CD68、MPO大多阴性。

若髓系有两个以上标记呈阳性，应考虑未成熟的急性髓细胞白血病。

流式上有低的SSC和FSC。

在CD45－SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志，如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。

一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4，一般HLA－DR、CD34阳性。

有些研究表明CD7与CD34共表达在AML，预后差。

M1：

骨髓中原始粒细胞（Ⅰ型+Ⅱ型）≥90%（NEC），并伴形态学异常。

早幼粒细胞很少，中幼粒细胞以下阶段不见或罕见。

流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA-DR－，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。

M2：

骨髓粒系明显增生，原始细胞明显增多，但可<

30%，以异常的中性中幼粒细胞增生为主，其胞核常有1-2个大核仁，核质发育显著不平衡。

M3：

骨髓中以颗粒增多的异常早幼粒细胞增生为主，早幼粒与原粒之比应在3：

1以上。

异常早幼粒细胞其胞核大小不一，胞质中有大小不等的颗粒，可见束状的Auer小体，也可逸出胞体之外。

依颗粒粗细分为粗颗粒和细颗粒两个亚型。

免疫标记具有髓系特征而HLA-DR阴性。

流式上显示高颗粒性，具较高的SSC，多数情况HLA-DR（-）或表达减少，CD34少于M2，一般CD13弱（＋），可有CD2表达。

M4与M5：

两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD4