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Rf值在0~1之间,相差越大,分离效果越好。
Rf值最大等于1,即该组分随展开剂上升至溶剂的前缘,表示溶质不进入固定相。
Rf值最小等于0,即该组分不随展开剂移动,仍在原点位置。
每种物质在一定的层析条件下都有它特定的Rf值,因此Rf值的大小也就成为各种物质定性分析的依据,从各物质Rf值间的差值大小即可判断彼此能否被分离。
而物质的Rf值相差越大就越容易分离;
如果斑点比较集中,则Rf值相差0.02以上时,即可相互分离。
2.1.2层析条件的选择
(一)纸的选择
选择质地厚薄均匀、纯净、疏松度适当、强度较大、平整的色层滤纸(通常用新华一号滤纸)。
(二)展开剂的选择
根据被分离物质的不同,选用合适的展开剂。
展开剂应对被分离物质有一定的溶解度,溶解度太大,被分离物质会随展开剂跑到前沿;
溶解度太小,则会留在原点附近,使分离效果不好。
选择展开剂应注意下列几点:
1能溶于水的化合物以吸附在滤纸纤维素中的水作为固定相,由于吸附水有部分是以氢键缔合形式与纤维素的羟基结合在一起,在一般条件下难以脱去,因而纸层析不但可用与水不相混溶的溶剂作流动相,而且也可以用丙醇、乙醇、丙酮等与水混溶的溶剂作流动相。
2难溶于水的极性化合物以非水极性溶剂(如甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺等)作固定相,以不能与固定相混合的非极性溶剂(如环已烷、苯、四氯化碳、氯仿等)作展开剂。
3对不溶于水的非极性化合物以非极性溶剂(如液体石蜡、а-溴萘等)作固定相,以极性溶剂(如水、含水乙醇、含水酸等)作展开剂。
2.1.3定性、定量分析的方法
(一)点样先用铅笔在距纸条一端2~3cm处划一直线(起始线),在线的中间划上“×
”,表示点样位置,即原点。
用内径约0.5mm的毛细管吸取试样溶液,轻轻与“×
”号处接触,使点样斑点的直径为0.2~0.5cm。
如果试液浓度较小,点样之后放在红外线灯下或用热吹风机使其干燥,再在原位置上进行第2次或第3次点样。
点样之后,要等干燥后再进行展开。
(二)展开展开方法中应用较广的是上行展开法。
展开剂放在密闭容器的底部,将滤纸点试液的一端浸入展开剂中,注意不要把原点浸入。
由于滤纸毛细管的作用,展开剂不断上升,与点在滤纸上的试样相遇,使试样中欲分离组分溶解在展开剂中随之上升,在两相间一次又一次的发生分配过程。
经一定时间后,取出滤纸,立即用铅笔划出溶剂的前沿位置。
(三)显色试样在滤纸上展开以后,如各个组分是有色的,在滤纸上可以看到各个色斑;
如为无色,可根据物质的特色喷洒适宜的显色剂进行显色。
配制显色剂时,尽量选择挥发性大的溶剂,以免喷在滤纸上之后引起斑点扩散、移动或变形。
显色之后,立即用铅笔划出各斑点的位置,以免退色或变色后不易寻找。
(四)定性分析在一定的操作条件,每种物质都有一定的Rf值,测定Rf值与手册对照。
但应注意,手册中的数据是在一定条件下测得的,仅供参考。
最好是在同一张层析纸上用标准品进行对照试验,比较它们的Rf值是否一致。
当一个未知物在纸上不能直接鉴定时,可分离后剪下,再用适当的方法鉴定。
(五)定量测定在相同条件下制得一系列标准色,与待测斑点颜色相比较,测定其含量。
也可将斑点剪下,用适当溶剂溶解后,再用其他方法测定。
技能训练
技能训练2.1纸层析分离操作
训练目的通过分离混合液中Cu2+、Fe2+、Co2+、Ni2+的操作,学会选择和使用层析纸、层析缸、展开剂等工具,熟悉纸层析的操作技术。
训练时间4h
训练目标通过训练,能正确选择和使用层析纸和展开剂,熟练掌握纸层析操作技术,并在4h内完成测定任务。
安全正确使用易挥发有机试剂。
仪器、试剂与试样
图2-2常用喷雾器
⑴仪器
1层析筒
2微量注射器50µ
L
3电吹风机
4噴雾器(见图2-2)
⑵试剂
1氨水
2显色剂(二硫代乙二酰胺溶液)
3展开剂丙酮:
浓盐酸:
水=90:
5:
5
⑶试样含有Cu2+、Fe2+、Co2+、Ni2+的混合液
测定步骤
⑴用剪刀将滤纸剪成长25cm、宽约2cm的纸条。
于纸的一端2cm处,用铅笔划一条直线。
2在直线的中心处用微量注射器点10µ
L试样液,样点的直径应小于或等于5mm,用电吹风机将样点吹干。
若样品溶液过稀,可在样点干燥后重复点样,必要时可反复数次。
图2-3层析筒
1-层析筒2-纸条
3-展开剂4-原点
3晾干后,将滤纸悬挂在盛有10mL展开剂,丙酮:
5的层析筒中,滤纸浸入展开剂约0.5~1cm,盖上层析筒盖(见图2-3)。
4待溶液前沿离试液原点20cm处(约1h),取出滤纸并放入盛有氨水的层析筒中熏5min。
取出晾干,用二硫代乙二酰胺溶液噴洒显色,可观察斑点颜色。
5用铅笔画出斑点的轮廓,量出原点至斑点中心的距离和原点至溶剂前沿的距离,计算各元素的Rf值。
Fe2+离子斑点显黄色,移动最快,其Rf=1.0;
Cu2+离子斑点显绿色,居第二位,其Rf=0.7;
Co2+离子斑点显深黄色,居第三位;
其Rf=0.46;
Ni2+离子斑点为蓝色,位居最后,其Rf=0.17。
(见图2-4)
图2-4Fe2+、Cu2+、Co2+、Ni2+
的纸上层析
1-Ni2+;
2-Co2+;
3-Cu2+;
4-Fe2+
注意事项
⑴不要用手指直接接触层析部分的滤纸,以防手上油脂污染滤纸。
⑵滤纸条必须剪得平整。
⑶滤纸周围必须为溶剂蒸气所饱和。
随溶剂蒸气压的大小和层析容器大小的不同,使容器中饱和地充满溶剂蒸气的时间可以由几分钟至数小时。
练习
1什么是Rf值,它在分析上有何应用?
2混合液中存在A、B两种物质,用纸层析分离法,它们的比移值分别为0.45和0.63,欲使分离后斑点中心之间相隔2cm,问层析纸应截多长为好?
2.2薄层层析分离法
薄层层析又称薄板层析,是将吸附剂(固定相)涂于玻璃或聚酯片上,以展开剂作流动相的色层分离法。
2.2.1基本原理
薄层层析法是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层,层析就在玻璃板上的薄层进行。
把试液点在层析板的一端,离边缘有一定距离,试样中各组分被吸附剂所吸附。
把层析板放入层析缸中,使点有试样的一端浸入流动相展开剂中。
由于薄层的毛细管作用,展开剂将沿着吸附剂薄层渐渐上升,遇到点着的试样时,试样就溶解在展开剂中,随着展开剂沿着薄层上升。
于是试样中的各组分就沿着薄层在固定相和流动相之间不断的发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。
经过一段时间的展开,试样中吸附能力最弱的组分最容易被解吸,它将随展开剂在薄层中移动最大的距离;
吸附能力较强的组分将在薄层中移动较短的距离。
于是试样中的各种组分将按其吸附能力强弱的不同而被分离开。
试样中各个组分在薄层中的位置同样也用Rf来表示。
和纸层析一样,在相同条件下进行层析时,某一组分的Rf值是一定的,因此可根据Rf值进行定性。
由于影响Rf值的因素很多,例如吸附剂的种类,粒度的活化程度,展开剂的组成和配比,层析缸的形状和大小,层析时的温度等。
要严格控制一致是困难的,因此文献上查的Rf值只供参考。
薄层层析法是在纸层析的基础上发展起来,和它们相比具有如下优点:
⑴快速只需10~60min;
⑵分离效率高可使性质相似的化合物如同系物,异构体等分离;
⑶灵敏度高可检出0.01μg(10-8g)的物质;
⑷层析后可以用各种方法显色;
⑸应用范围广它可以进行定性和定量测定。
适用于医药、食品、染料等产品中微量组分的测定。
2.2.2层析条件的选择
在薄层分析中,为了获得良好的分离,必须选择适当的吸附剂和展开剂。
(一)吸附剂的选择
吸附剂必须具有适当的吸附能力,而与溶剂、展开剂及欲分离的试样又不会发生任何化学反应。
吸附剂都做成细粉状,一般以200~300目较为合适。
吸附剂种类较多,有硅胶、氧化铝、纤维素和聚酰胺等。
应用最多的是氧化铝和硅胶。
用吸附剂制层析板时,一般将板制成软板和硬板两种。
软板(又称干板)是直接用吸附剂铺成的板。
硬板是在吸附剂中加入一定量的粘合剂(煅石膏、淀粉等),按一定比例加入水制成的板。
这种板可以增大板的机械强度。
制成的硬板在使用前应于105~1100C烘干活化,驱除水分,增强其吸附能力。
根据活化后含水量的不同,其活性可分为五个等级,如表2-1所示。
Ⅰ级活度最大,Ⅴ级活度最小,这两种都很少使用,使用最多的是Ⅱ~Ⅲ级或Ⅲ~Ⅳ级。
一般制成的板在1100C活化30min后活度可达Ⅱ~Ⅳ级。
表2-1吸附剂活度级
吸附剂
含水量,%
活度级
硅胶
15
25
38
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
氧化铝
3
6
10
⑴对于吸附层析,主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。
常见的功能团按其极性增强次序排列为:
烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<酯类<酮类<醛类<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸类
⑵除要考虑展开剂的极性外,也要考虑被分离组分的极性和吸附剂的活性。
这三者是相互关联相互制约的。
在选择展开剂时,一般先用单一的溶剂,然后再用两种混合溶剂,这要根据分离效果而定。
一般说来,类似结构的同系物,往往可以用相同组成的展开剂。
例如在中性氧化铝薄层上分离氨基蒽醌、甲基氨基蒽醌、氨基氯蒽醌的各种异构体时,都可用环己烷:
丙酮(3:
1)混合剂作展开剂。
⑶分配层析是基于试样中各组分在展开剂中溶解度的不同,或者更严格地讲是基于各组分在固定相和流动相中分配系数的不同达到分离的目的。
分配系数大的能达到很好的分离。
也要考虑到展开剂是否易挥发,粘度是否较小。
易挥发的展开剂在展开后能很快挥发逸去,不影响定性和定量的测定。
粘度小的展开剂一般展开速度较快。
另外,也要选择纯度比较高的展开剂,一般可用分析纯或化学纯。
试剂含有杂质如含水、含氧酸等都会使溶剂的极性发生明显的改变,影响分离。
2.2.3定性、定量分析的方法
(一)定性分析
显色后可以根据各个斑点在薄层上的位置计算出Rf值,然后与文献记载的Rf值比较以鉴定物质。
但是薄层层析Rf值的影响因素很多,重现性较差,文献上查到的Rf值只能供参考。
Rf值受到下列因素的影响:
吸附剂的性质和质量(粒度、纯度等)与展开剂中的杂质如水分等,当用同一种吸附剂和展开剂时,被测物质的Rf值受到薄层厚度、含水量(活度)、点样量、展开方式、层析缸的大
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