吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN表达的关系Word文档下载推荐.docx

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各个细胞系中PTENmRNA和PTEN蛋白均有表达。

结论吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTENmRNA和PTEN蛋白表达水平无明显相关，即PTEN表达状态还不能作为预测结肠癌对吉非替尼敏感性的可靠生物学指标。

【关键词】结肠肿瘤；

细胞系；

PTEN；

吉非替尼；

生长抑制

　　RelationshipbetweenPTENexpressionsandinhibitoryeffectsofGefitinibonthegrowthofcoloncancercells

【Abstract】ObjectiveToobservetheinhibitoryeffectofGefitinib,aselectiveoralepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor,onthegrowthofhumancoloncancercells,andinvestigatetherelationshipbetweenthesensitivityofcoloncancercellstoGefitinibandPTENexpressions.MethodsTheinhibitoryeffectsofGefitinibon6kindsofcoloncancercells,thelevelsofPTENmRNAindifferentcoloncancercells,andPTENproteinexpressionsincoloncancercellsweredetectedbyMTTassay,RT-PCRandWesternblot,respectively.ResultsTheinhibitoryeffectsofGefitinibonthe6coloncancercellsinvitrovariedalot.WhentheconcentrationofGefitinibwas1μmol/L,LovocellshadthemostsensitivitytoGefitinibwithanIC5010μmol/L;

HT29andSW480hadmoderatesensitivity,andtheIC50rangedfrom10μmol/Lto100μmol/L;

HCT116,LS174TandSW620wereinsensitivetoGefitinib,andtheirIC50100μmol/L.AllthecoloncancercelllinesexhibitedPTENmRNAandproteinexpressions.ConclusionsPTENmRNAandproteinexpressionsmightnotbeassociatedwiththeinhibitoryeffectsofGefitinibonthegrowthofcoloncancercells.TheexpressionofPTENcannotbetakenastheindicationofthesensitivityofcoloncancercellstoGefitinib.

【Keywords】Coloncancer;

Cellline;

PTEN;

Gefitinib;

Growthinhibition

吉非替尼是目前备受关注的靶向治疗药物，是一种具有口服活性的选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，能阻断EGFR激活的多条信号通路。

吉非替尼对不同的结肠癌细胞系均表现出不同程度的抗肿瘤活性［1-2］。

PTEN是一种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，当PTEN功能减弱或缺失，可引起EGFR下游通路中的Akt过度活化，降低细胞对凋亡的敏感性。

本文将探讨结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性与PTEN表达的关系。

　　1材料与方法

　　细胞系培养

人结肠癌细胞系Lovo、HCT116、HT29为本室传代保存，LS174T、SW480、SW620购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

SW620用LeibovitzL-15培养液，其余以DMEM高糖培养液培养，其中含10%胎牛血清，各100U/ml的青霉素、链霉素，用%胰酶消化传代。

取对数生长期的细胞用于各项实验。

　　药物和主要试剂

吉非替尼溶解于二甲基亚砜中，储存浓度为200mmol/L，-20℃保存，仅在每次实验前用新鲜培养液稀释至所需浓度，作用于细胞的DMSO浓度不超过%。

二甲基四氮唑蓝、DMSO等购自美国Sigma公司；

Tripure为瑞士Roche公司产品；

M-MLV逆转录酶为美国Promega公司产品；

混合Taq酶为北京天为时代科技有限公司产品；

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；

抗PTEN抗体购自美国CellSignalingTechnology公司；

内参β-肌动蛋白抗体购自美国SantaCruzBiotechnology公司；

化学发光试剂盒购自美国PierceBiotechnology公司。

　　体外药物敏感实验

调整细胞浓度后取100μl以每孔含细胞数5000个接种于96孔培养板中，37℃孵育24h后，每孔加入含不同药物浓度的完全培养液100μl，对照组不含药物只加入等量的DMSO，每组设4个复孔，继续孵育72h。

每孔加20μl二甲基四氮唑蓝液，培养4h后小心吸去培养液，每孔加入200μlDMSO。

用Model550型酶标仪在490nm下测吸光值，计算药物的细胞生长抑制率：

抑制率＝×

100%，并求出半量抑制浓度，每个实验重复3次。

RT-PCR检测

按Tripure试剂说明提取细胞总RNA，取2μgRNA合成cDNA。

根据GeneBank提供的PTENmRNA序列设计合成引物。

上游引物：

5′-GGTTCACATCCTACCCCTTTG-3′，下游引物：

5′-CATTCTTTGTTGA-TAGCCTCCA-3′，产物长度453bp。

PCR反应条件：

94℃预变性2min；

94℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；

72℃延伸10min。

PCR产物用%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照，产物长度715bp。

　　Westernblot检测

以RIPA细胞裂解液提取各种细胞总蛋白。

以Bradford法测定蛋白浓度。

取各组50μg蛋白上样，经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜。

抗PTEN一抗4℃孵育过夜。

HRP标记的二抗室温孵育1h，避光显影检测杂交信号。

　　统计学分析

数据用x±

s表示，应用SPSS软件进行单因素方差分析。

为差异有统计学意义。

　　2结果

　　结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性

吉非替尼在体外对6种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大。

在吉非替尼作用浓度为1μmol/L时，Lovo结肠癌细胞系的抑制率已达34%，

　　结肠癌细胞系PTENmRNA表达

RT-PCR结果显示，Lovo、HCT116、HT29、LS174T、SW480和SW620结肠癌细胞系均不同程度表达PTENmRNA。

其灰度值依次为±

，±

，其中LS174T表达最强，其他细胞系间无差异。

　　结肠癌细胞系PTEN蛋白表达

Westernblot检测结果可见，Lovo、HCT116、HT29、LS174T、SW480和SW620结肠癌细胞系的PTEN蛋白均有表达，但表达相差不大，见图4。

。

　　各结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性与相应PTEN表达水平的关系

Lovo细胞系对吉非替尼最为敏感，LS174T、HCT116和SW620的敏感性最差，耐药倍数是Lovo的20～30倍，而PTEN表达在Lovo与耐药细胞之间的差异性却不明显。

另外HT29和SW480属中度敏感，但其PTEN表达与对吉非替尼最不敏感和最敏感的结肠癌细胞之间相差也不明显。

　　3讨论

目前，吉非替尼对结肠癌细胞生长抑制作用的研究多集中于EGFR和磷酸化EGFR表达以及EGFR酪氨酸激酶域突变［3］。

然而越来越多的研究发现EGFR突变在结肠癌中并非一个常发事件，并且EGFR活性也不能完全决定肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性［4］。

EGFR的下游信号通路并不为药物所阻断，可能是细胞内的信号发生变异，不依赖EGFR转导的信号而促进肿瘤细胞增殖［5］。

PI3K/Akt通路是EGFR下游信号通路的关键组成部分，在肿瘤细胞对吉非替尼产生耐药时PI3K/Akt通路活性也有所改变。

当PTEN功能减弱或缺失，在细胞膜上磷脂酰肌醇三磷酸盐积聚，将引起Akt的异常活化。

PTEN在多数恶性肿瘤中表达降低或缺失，在肿瘤发生、发展和转移中发挥重要作用，而且在PI3K/Akt通路中最易发生活性改变［6］。

本研究入组结肠癌细胞系以RT-PCR和Westernblot检测PTENmRNA和PTEN蛋白均有不同程度表达，其中mRNA水平以LS174T表达最强，而在蛋白水平LS174T和其他细胞系差异不明显。

这可能与转录后的蛋白翻译和修饰有关。

研究结果与国外文献报道相符［7］。

PTEN表达缺失在结肠癌可能并不常见，也许PTEN多表现为表达减弱或功能失活。

本研究观察了6种人结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性，其结果与大多文献报道的结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性基本相符［2，8］。

关于肿瘤细胞PTEN表达与吉非替尼敏感性的关系观点尚不一致。

恶性胶质瘤LN229细胞系具有野生型PTEN，且功能完整，磷酸化Akt处于低表达水平，而该细胞系对吉非替尼的生长抑制作用并不敏感，认为PTEN表达与耐药机制无关［9］。

临床研究以免疫组织化学染色法检测93例非小细胞肺癌患者PTEN的表达状况，发现该基因表达缺失与磷酸化Akt表达水平和患者对吉非替尼的治疗反应性无明显相关，推断PTEN不是预示非小细胞肺癌原发性耐药的生物学指标［10］。

然而也有结论不一致的研究，认为PTEN的表达状态与吉非替尼耐药有关。

吉非替尼诱导MDA-468乳腺癌细胞系产生继发性耐药后，PTEN出现突变或表达缺失以及PI3K/Akt活性上调。

以腺病毒转染野生型PTEN到PTEN表达缺失的耐药肿瘤细胞中，可观察到PI3K/Akt活性降低以及对吉非替尼反应性提高［11］。

PTEN表达下降或缺失是引起非小细胞肺癌细胞系对吉非替尼原发性耐药的机制之一，下调PI3K/Akt