甜叶菊糖甙的提取纯化及分离检测方法研究文档格式.docx
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交换吸附精制甜叶菊糖甙,冷冻干燥后得到甜叶菊糖甙结晶粉末。
甜叶菊糖甙组分的分离方法主要有重结晶法、层析法。
重结晶法利用甜叶菊糖甙各主要组分在乙醇溶液中溶解度的不同进行结晶将主要组分分离;
层析法是利用甜叶菊糖甙主要组分在装有硅胶的层析柱中被吸附和解吸速度的不同将甜叶菊糖普主要组分分离。
检测甜叶菊糖甙含量的主要方法有重量测定法、液相色谱法、薄板层析法、分光光度法(蒽酮为显色剂)、分光光度法(DNS试剂为显色剂)、化学发光法等。
采用硅胶G薄板层析法,展开体系:
正丁醇:
乙酸:
乙醚:
水(9:
6:
3:
l),能十分清晰将甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖分开,可以定性检测甜叶菊糖甙的两种主要单体组分。
分光光度法(蒽酮为显色剂)和分光光度法(DNs试剂为显色剂)都可以测定甜叶菊糖甙的主要组分,方法简便,对实验设备要求不高,但准确度不高、误差大。
流动注射化学发光法测定甜叶菊糖甙是我们最近研究出来的一种新的测定方法,能够准确测定出甜叶菊糖甙的含量,与其他测定甜叶菊糖甙的测定方法相比,其准确度、灵敏度都很高,这一测定方法在国内外尚属空白。
具有一定的理论意义和实际应用价值。
关键词:
甜叶菊糖甙;
提取;
纯化;
测定
1前言
1.1研究的目的与意义
甜叶菊原产于巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉,土壤条件是古代水成岩及火成岩的风化土壤。
呈现出明显的局部特异性土壤分布,多含沙壤土和腐殖质土,肥力较差。
气候条件因地势及地形的原因,降雨量较多,温差较大,且有霜降现象,可认为近似温带气候,整个生长期温度都在20℃以上。
甜叶菊具有喜温性,种子萌发的最适温度为20一25℃,营养生长期温度也要求22℃以上,开花的最适温度为18一22℃。
甜叶菊属感光性强的短日照植物,临界夜长大于12h。
长日照反应期分别在现蕾前13一14d和开花前26~30d,此阶段为花芽形成诱导期。
此时期需具备少于12h的短日照才能正常开花,所以短日照是甜叶菊由营养生长转到生殖生长的关键(鲍志华,1999)。
甜叶菊作为糖料植物,早在第二次世界大战时就曾引起过国际重视。
1970年日本从巴西引进甜叶菊,开始驯化、栽培、制昔,同时进行毒理、食品检测等试验,并首先开发利用甜叶菊产品一甜叶菊糖甙。
我国于1976年从日本引种试种,并获成功。
目前除中国、日本引种和推广外,韩国、泰国、菲律宾等也有不同程度的推广栽培(T宁等2004,杨丹等2005)。
我国自1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。
80年代初向全国各地推广种植,生产的甜叶菊干叶主要出口日本。
1982年成都化学制药厂科技人员首次研制甜叶菊糖甙生产技术成功,紧接着,天津南开大学、北京商业机械化研究所分别在江苏镇江和湖南西湖农场兴建甜叶菊厂试产成功。
1985年卫生部批准甜叶菊糖甙在饮料、糕点和糖果中使用,而且用量不受限制,1996年我国甜叶菊糖甙产销量突破千吨大关(唐志发,1999),1997年产销量达到1400吨左右,其中80%左右为出口,我国现已成为世界上最大的甜叶菊糖甙生产国和出口国。
我国的甜叶菊糖甙发展之所以如此迅速,与其生产原料充足密切相关。
甜叶菊适应性强,我国自海南到新疆,从云南到黑龙江,除高寒和无灌溉条件的地区外,均可种植,南方每年收成2一3次北方每年一收。
事实证明,发展甜菊糖对我国国民经济发展有着重要的意义。
甜叶菊糖营是由甜叶菊的叶片提取,是一种天然无热量高倍甜味剂,它在体内不参加代谢、不蓄积、无毒性,其安全性已得到国际FAO和WHO等国际组织的认可,2004年7月6日世界联合卫生组织正式通过允许甜叶菊糖甙在世界范围内通用的决议,这为甜叶菊糖甙的安全性提出了有利的证明。
因此,甜叶菊是一种安全的天然甜味剂。
我国卫生部自1985年和1990年分别批准甜叶菊糖甙为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料,用其制成的食品饮料,长期食用不会使人发胖,特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用,而且物理、化学性能稳定、无发酵性,可延长甜叶菊糖营制品的保质期。
因而,被广泛应用在食品和药物行业中,被誉称为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源(李钦等1994,沈秀丽等1995),有着广泛的应用范围和宽阔的市场前景。
现在吃得更营养,吃得更健康逐渐成为消费者关心的重点。
因此,低热量低脂肪的甜味剂甜叶菊糖甙也随之热起来,国内对甜叶菊糖甙的功能开发已初具规模,年产甜叶菊糖甙700多吨,不仅满足了国内市场的一部分需要,而且少量出口到世界其他国家和地区,所以甜叶菊糖甙有着广阔的市场前景,而提高产品质量、降低生产成本、从生产实际出发、简化提取分离纯化工艺是我们面临的重要课题。
因此本文对甜叶菊糖甙的提取、纯化、分离、检测的试验方法进行研究讨论,探讨操作简便、灵敏度高、成本低的提取、纯化、分离、检测甜叶菊糖甙的方法。
1.2国内外研究动态与趋势
1.2.1国内外(日本)甜叶菊研究发展概况
1970年开始,日本首先将甜叶菊从巴西引种,并且从叶片中提取出甜菊糖的作为了甜味剂,在食品、药品等行业得到了广泛的应用。
70年代起,日本、美国、韩国、巴西等国家先后进行过动物急性毒理、亚急性毒理、长期毒理学试验。
日本药理学家明石和光桥(1978一1982年)数次反复试验,同时进行动物急毒、亚急性毒理、长期毒理学试验。
结果表明,糖甙对动物没有任何毒害作用,且对肿瘤病变有控制作用,这是三萜类抑制亚硝铵再合成的作用所致,对人体代谢功能无任何不良影响。
在对糖尿病病人的用量试验,未发现任何副作用,且对人体代谢功能无任何不良影响。
St和RA的结构未发生变化即从体内排出,对动物无急毒性,同时也证明了对动物的生殖能力、变异性、遗传均不存在慢毒性。
甜叶菊糖甙作为食品添加剂被认可的巴西和日本使用已经有30多年的历史。
截止到2004年底,日本申请产权保护的有4个品种,其中3个都己经保护期满,这些品种都不是转基因植物。
甜叶菊的植物生物化学、栽培方法、病害等也进行了大量的研究。
几十年的农业生产表明:
在日本农业生产成本比较高。
因此,目前的干燥甜叶菊叶片或粗糖甙产品儿乎来自于中国的黑龙江省、山东省、安徽省。
日本甜叶菊糖甙的研究主要集中在北海道的东北大学农学部等7个单位;
甜叶菊工业协会有10个公司参加。
35年来,出版书籍近十部;
发表论文近200篇;
专利近20个。
相对国外的甜叶菊糖甙的研究,我国起步较晚,研究进展缓慢,近期,郝再彬、胡献丽等学者先后对甜叶菊及其糖甙的研究、发展、利用进行了大量的综述,表明了中国发展速度缓慢,各方面有待深入研究。
在许多方面取得了一定的成绩,如:
糖营提取方法及工艺研究;
栽培技术及病害防治;
离体培养及工厂化生产;
糖甙的可见光检测、紫外线检测、化学发光检测;
基因分析等。
但是国内水平与国际相比差距很大。
1.2.2甜叶菊的结构分布与理化性
1.2.2.1甜叶菊糖甙的结构
甜叶菊糖甙是从干燥后的甜叶菊叶片中提取出来的一类具甜味的萜烯类配糖体。
目前为止,己从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖甙。
其中Stevioside是主要成分,占60%一70%,甜度为蔗糖的300倍;
其次是RebaudiosideA,占15%一20%,甜度为蔗糖的450倍,且甜味最接近蔗糖,其他组分含量都较少(舒世珍等1998)。
甜叶菊叶片中含的甜味成分主要有八种(赵瑜藏等2000):
(l)甜叶菊糖甙(stevioside)
(2)甜叶菊醇双糖甙(steriolbioside)
(3)莱包迪甙A恤baudiosideA)(RA)
(4)莱包迪甙B(rebandiosideB)(RB)
(5)莱包迪甙e(rebaudiosideC)(RC)
(6)莱包迪甙D(rebaudiosideD)(RD)
(7)莱包迪甙E(rebaudiosideE)(RE)
(8)杜尔可甙A(duleosioleA)(Dul-A)
这些配糖体中含量高、且有经济价RA,不论从甜度和味质上均受到好(totalstevfoside)表示甜叶菊总甙是表示
莱包迪甙A结构式如图1:
研究合适的纯化方法,分离去除其中的杂质(包括蛋白质、糖类、无机盐等)显得尤为必要。
目前天然产物的纯化方法较多,主要有沉淀法、萃取法、酸碱法、吸附法、层析法和超临界C02流体萃取法等。
本文采用沉淀法、吸附法研究了甜叶菊糖甙的纯化方法(刘宗林等2002)。
沉淀法是加入一种沉淀剂和混合物中的杂质反应生成沉淀,过滤沉淀。
因此采用沉淀法可以初步纯化甜叶菊糖甙(刘永宁,1993)。
树脂吸附法是一种具有多孔立体结构的聚合物吸附剂,它是依靠其与被吸附分子之间的范德华引力,通过其巨大的比表面积进行物理吸附过程。
1.2.5甜叶菊糖甙的分离方法
1.2.5.1层析法
利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。
由于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异,因此在层析柱中扩散的速度不同,利用这一点将各组分分开(沈秀丽等1995,陈天红等1998)。
1.2.5.2重结晶法
通过研究甜叶菊糖甙在甲醇一水混合液中溶解度的差异,采用较为简单的工艺技术将甜叶菊糖甙提取液经提取、脱色、吸附等处理后,再在一定配比的甲醇一水体系中重结晶,得到了RA含量高于60%的甜味剂产品,从根本上改进了甜叶菊糖的味质(张杨1998,刘宗林
2002)。
1.2.6甜叶菊糖甙的检测方法
1.2.6.1薄板层析法
薄板层析法是利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。
由于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异,在薄层上展开时,极性较强的糖甙如RA展开速度要慢一些,而极性弱的物质相对展开较快。
再选用适宜的显色剂显色,定性鉴别甜叶菊糖甙〔〔FujinmaK1986,黄海水等1990)。
1.2.6.2高效液相色谱法
高效液相色谱法作为一种高效、高灵敏度的检测手段己被广泛用于甜叶菊糖各组份的分离、测定研究。
色谱固定相的成份与淋洗液极性的搭配是分离效果的关键(黄晓兰1989,李敬慈1997)。
美国人Robert等人通过改变萃取剂组份比以及使用含氧有机固定相,通过硅
原子以共价键连在无机载体上做为色谱填料,用HPLC将甜叶菊提取液中八种糖甙组份实现了一次分离。
MakaPugay等人选用氨基固定相Zorbax一NHZ为色谱柱,乙睛一水作流动相,用线性梯度洗脱法在十儿分钟内将八种组份分离。
特别值得一提的是,MakaPugay等人还对包括中国在内的几个国家和地区的甜叶菊干叶组份含量进行了对比测定(Manrip,19%)。
1.2.6.3分光光度法(蒽酮为显色剂)
甜叶菊的甙元是四环二萜类化合物,在C一4位的梭基上连接着一个葡萄糖基,在C-13位上以槐糖形式连接两个葡萄糖基,构成甜叶菊糖甙。
在酸性溶液中,甜叶菊糖甙易水解脱去基团上的葡萄糖基,剩下的甙元(异甜叶菊醇)不溶于水,可过滤分离。
在相同的条件
下水解,脱落葡萄糖的数量是相同的,它与蒽酮试剂反应生成稳定的绿色溶液。
在波长620nm处有一个最大的吸收峰,浓度在0一80ppm
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