谷胱甘肽中文概述Word格式.docx
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2.5碘量法
3几种谷胱甘肽的制备方法
3.1 溶剂提取法
3.1.1 谷胱甘肽的提取
3.1.2 谷胱甘肽的分离纯化
3.2 化学合成法
3.3 酶合成法
3.4 发酵法
谷胱甘肽(Glutathione)
1.1GSH的结构特征
GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成,分子中有一特殊的γ-肽键,即由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2缩合成的肽键,它不同于蛋白质分子中的普通肽键。
GSH为白色晶体,易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
2分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽(GSSG),又称谷胱甘肽二硫化物,多以水合物形式存在,是溶于水的白色晶体。
胱甘肽的相对分子质量为307.33;
熔点为189~193℃(分解);
溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺,不溶于醇、醚和丙酮;
谷胱甘肽固体较为稳定,水溶液在空气中则易被氧化[5]。
两分子GSH的活泼巯基氧化脱氢转变为一分子GSSG,但只有GSH才具有生理活性。
GSH分子含有γ-谷氨酰基和活性巯基,是GSH许多重要生理功能的结构基础。
GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂存在,维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。
GSH还广泛存在于其它正常细胞中,有很强的亲和力,能与多种化学物质及其代谢物结合,清除体内氧自由基及其它自由基,具有保护肝细胞膜、促进肝酶活性、抗氧化、解毒等作用,是人体细胞内的主要代谢调节物质。
GSH还在蛋白质和DNA合成、物质运输、酶活性、新陈代谢及细胞保护等生物学功能中起着直接或间接的作用。
它还是许多酶反应的辅基,可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基,清除体内过多的自由基,参与体内三羧酸循环及糖代谢,具有解毒、预防糖尿病、癌症及消除疲劳等作用
GSH广泛应用于食品领域,如加入酸奶和婴儿
食品起类似维生素C的稳定作用;
防止水果罐头水果褐变在面制品中起还原和强化氨基酸作用;
缩短面包混揉时间GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉类风味;
GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解,
1.3总谷胱甘肽测定方法(营养学报)
NADP2GSHDTNB
↑↑GR↓↓
H++NADP(NADPH)GSSG2TNB+2H+
NADP(NADPH):
氧化型(还原型)辅酶I
GR:
谷胱甘肽还原酶
在次反应中,NADPH量逐渐减少,TNB量逐渐增加,TNB在412nm吸收增加的速率与总GSH量呈正比。
由于GSH和GSSG循环交替,周而复始总量不变,故称此为循环法。
郭黎平等[6]{郭黎平,刘国良,张卓勇,等.铜(Ⅱ)-新铜试剂-谷胱甘肽乙醇体系显色反应研究[J].光谱学与光谱分析,2000,20(30):
412-414.}在测定大豆提取液中谷胱甘肽的含量时,发现在铜(Ⅱ)-新铜试剂-谷胱甘肽-乙醇体系中测定谷胱甘肽的含量,乙醇具有明显的增敏作用。
采用CuSO4溶液和新铜试剂混合液[Cu2+-新铜试剂(1:
2.5,摩尔比)]作为显色剂,检测波长为456nm,检测限为2.0ug/ml,线性范围为2.0~24ug/ml,回收率为99.54%,RSD为0.76%。
赵旭东等[2]{赵旭东,魏东芝,万群,等,谷胱甘肽的简便测定法[J].药物分析杂志,2000,20
(1):
34-37}根据甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应速度的不同,提出了在含有其它巯基物质溶液中测定谷胱甘肽含量的方法,通过控制两个相同供试品和甲醛的不同反应时间,测定两者在波长为412nm时的吸收度,根据两者不同的吸收度值得出谷胱甘肽的含量。
线性范围为0.19~0.95g/L,回收率为96.7%,方法的结果误差小于0.5%。
该方法实验成本低,分析快速、简单,适于测定生物合成反应液中谷胱甘肽的含量。
曹新志等[7]{曹新志,陈彦.荧光法测定黄瓜中的谷胱甘肽[J].资源开发与市场,2000,16(5):
272-273。
}采用邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPT)作为络合剂,在磷酸缓冲液(pH8.0)中,应用荧光分光光度计来测定黄瓜中谷胱甘肽的含量。
检测限为0.1ug/ml,线性范围为0.1~40ug/ml,回收率为99.73%,RSD为1.24%。
Hissin等[8]选用OPT作荧光剂,采用偏磷酸-磷酸钠-EDTA缓冲溶液(pH8.0),用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷胱甘肽的含量,谷胱甘肽的检测限为0.05umol,线性范围为0.05~0.8umol,RSD为4%。
张建莹等[9]{张建莹,齐剑英等,锌离子增强荧光光谱法测定谷胱甘肽[J].暨南大学学报,2004,25
(1):
88-91}探讨了金属离子对还原型谷胱甘肽(GSH)-邻苯二甲醛(OPA)体系荧光信号的影响,实验结果表明Zn2+对体系的荧光信号有增强作用,而且Zn2+能够提高GSH-OPA体系的稳定性,据此建立了一种以Zn2+作为荧光增强剂,快速简便测定还原型谷胱甘肽的新方法。
GSH在1.3×
10-8~1.4×
10-6mol/L的范围内其浓度与体系相对荧光强度有良好的性关系,检出限为1.1×
10-8mol/L.本实验方法比较适合生物样品中还原型谷胱甘肽浓度的测定。
HPLC是近年测定复杂生物样本中各种巯基物的最好主法。
HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间由于分配系数、吸附能力、亲和力、分子大小不同,进行连续分离的过程。
HPLC法优点是可以区分开GSH、GSSG及20多种含巯基氨基酸衍生物。
其不足是灵敏度不高,样本中GSH含量不得低于50umol/L;
且样本的前处理过程耗时,测定大样本时不方便,所用的柱特殊[5]{攀跃平,于健春等,谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价,中国临床营养杂志,2003,11
(2):
136-139}。
A.Rodrigueuz-Ariza等[10]ArizaAR,ToribioF,BareaJL.RapiddeterminationofglutathionestatusinfishLiverusinghigh-performanceliquidchromatographyandelectrochemicaldedection[J].JournalofChromatographyB,1994,656:
311-318介绍了一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法。
该法应用一套双通道电化学测定仪,可同时测定GSH、GSSG还可测定PSSG(蛋白结合谷胱甘肽),具有高灵敏度、高选择性、高效的优点。
Chung-shiYang等介绍了一种将HPLC与微透析机联机测定谷胱甘肽。
此法缩短了分析测定时间,简化了样本的准备过
程,并提供了连续的监测[5]{攀跃平,于健春等,谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价,中国临床营养杂志,2003,11
(2):
136-139}程敬君等采用KCI溶液-HCI溶液-甲醇-EDTA为流动相,电化学检测器(工
作电极为玻碳电极,参比电极为Ag/AgCI,工作电压为0.9V),测定鼠脑微透析液中谷胱甘肽的含量,检测限为10nmol/L,回收率为87.3%,RSD为1.8%。
Brent等用甲醇和乙酸钠溶液(pH7)作为流动相,对苯二醛(Orthophthalaldehyde,OPA)和谷胱甘肽络合生成一种高荧光的三元环衍生物,荧光检测器,检测限为0.1pmol,线性范围0.1~200pmol,谷胱甘肽的回收率为99.2%,RSD为1.2%。
该方法线性范围较宽,而且稳定性较高,适于测定混合
组分中谷胱甘肽含量[11]{杨培慧,齐剑英,冯德雄,蔡继业.谷胱甘肽的应用及其检测方法[J].中国生化药物杂志,2002,23
(1):
52-54}
2.4DTNB法
GSH和DTNB反应生成黄色的5-硫代-2硝基苯甲酸,在412nm波长有最大吸收峰。
方法:
样品1式2份,pH8.0条件下分别和甲醛反应2min和60min,各取1mL加入5mLDTNB溶液,25℃反应5min后分别测定在波长412nm的吸光度,算出2者的差值△A,代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。
得到谷胱甘肽浓度在0.19~0.95gL-1之间线性关系良好,回归方程为:
Y=0.7154X-0.0004,r=0.9999,最大误差不超过6%。
本方法成本低廉,简单易行,特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析[2]{赵旭东,魏东芝,万群等,谷胱甘肽的简便测定法}。
DTNB法中,反应显色后30min以内光密度未见降低,显色稳定。
相对误差可以控制在2%以内,相对标准偏差可以控制在4%以内,说明这种方法的准确度和精密度较高,且半胱氨酸不干扰测定结果。
刘娟等[15]{刘娟,王雅琴等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较[J].北京化工大学学报,2004,31(3):
35-38}对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下:
将分样品0.5mL加入1.5mL0.15mol/LNaOH溶液中,摇匀,加入体积分数φ=0.03,甲醛0.5mL,摇匀,静置2min。
加入2.5mLDTNB分析溶液,摇匀,在25℃水浴保温5min,测定在波长412nm处的吸光度A,通过计算或从标准曲线上得出相应GSH浓度。
DTNB法经改进后,其灵敏度比原先提高了三倍。
另外,蓝金贵等报道了一种快速、简便和廉价的谷胱甘肽(GSH)含量测定的新方法。
利用GSH的还原性将磷钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝,在710nm最大吸收波长处测其吸光度,吸光度与GSH的浓度在3.3×
10-7-1.3×
10-4mol/L范围内呈线性关系,相关系数r=0.9982,方法检测限为1.6×
10-7mol/L,相对标准偏差RSD=1.1%(n=6),回收率为97.1%-103.5%。
该法应用于药品中GSH含量的直接测定,结果满意。
2.5.1原理:
本法是利用GSH的还原性与碘酸钾反应,当GSH全部反应完时,碘酸钾将碘化钾氧化为碘,碘使淀粉指示剂变为蓝色,即为滴定终点。
碘酸钾消耗量与GSH的含量成正相关,由此制作标准曲线。
再用碘酸钾滴定以不同方法提取的被测样品,根据所消耗碘酸钾的量(mL),从曲线上找出相应的GSH质量浓度(g/L),计算每g干酵母中GSH的质量分数。
2.5.2制作GSH标准曲线:
首先配制1g/L的GSH标准溶液,然后取GSH标准溶液于250mL锥形瓶内,加入5mL质量分数2%的偏磷酸溶液、1mL质量分数5%的碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂,用0.0001mol/L的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止,记录碘酸钾体积(如表2所示)。
重复2次,取平均值,以GSH质量浓度(g/L)为横坐标,碘酸钾消耗量(mL)为纵坐标,制作标准曲线,
3 几种谷胱甘肽的制备方法
由于谷胱甘肽具有重要的生理功能和广泛的市场前景,因此,谷胱甘肽的工业化生产越来越受到关注。
日本早在20世纪50
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