医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版Word文件下载.docx
- 文档编号:15338907
- 上传时间:2022-10-29
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:585.29KB
医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版Word文件下载.docx
《医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版Word文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《医院感染铜绿假单胞菌抗菌药物多重耐药基因的研究论文版Word文件下载.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
离心15000r/min30s,移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液置入-20℃冰箱备用。
1.4基因检测 均为PCR法,各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。
各种靶基因PCR扩增体系均为:
每反应体系P1、P2引物各0.5μM,KCl10mM,(NH4)2SO48mM,MgCl22mM,Tris-HCl(pH9.0)10mM,NP400.5%,BSA0.02%(wt/vol),TaqDNApol1U。
总反应体积20μl(其中模板液5μl)。
热循环参数(>
500bp)PCR为:
93℃预变性2min,然后93℃60s→55℃60s→72℃60s,循环35周期,最后一个72℃延长至5min,其余均为:
93℃预变性2min,然后93℃30s→55℃30s→72℃60s,循环35周期,最后一个72℃延长至5min。
产物经2%琼脂糖凝胶电泳,出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。
耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
表1:
耐药基因PCR引物序列
基因名称
引物序列(5′→3′)
产物长度
TEM
P1:
AGGAAGAGTATGATTCAACA
535bp
P2:
CTCGTCGTTTGGTATGGC
SHV
GGCTATGCGTTATATTCGCC
867bp
GGTTAGCGTTGCCAGTGC
CTX-M
ATGGTTAAAAAATCACTGCGC
833bp
TCCCGACGGCTTTCCGCCTT
OXA-10group
GTCTTTC(A/G)AGTACGGCATTA
822bp
GATTTTCTTAGCGGCAACTTA
PER
AGTCAGCGGCTTAGATA
978bp
CGTATGAAAAGGACAATC
GES
ATGCGCTTCATTCACGCAC
846bp
CTATTTGTCCGTGCTCAGG
VEB
GCGGTAATTTAACCAGA
961bp
GCCTATGAGCCAGTGTT
CARB
AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC
588bp
TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC
DHA
AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT
405bp
CCGTACGCATACTGGCTTTGC
IMP
CGGCC(G/T)CAGGAG(A/C)G(G/T)CTTT
587bp
AACCAGTTTTGC(C/T)TTAC(C/T)AT
VIM
ATTCCGGTCGG(A/G)GAGGTCCG
633bp
GAGCAAGTCTAGACCGCCCG
OprD2
GCGCATCTCCAAGACCATG
193bp
GCCACGCGATTTGACGGAG
aac(3)-Ⅱ
ACTGTGATGGGATACGCGTC
237bp
CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA
aac(6′)-Ⅰ
TATGAGTGGCTAAATCGA
394bp
CCCGCTTTCTCGTAGCA
aac(6′)-Ⅱ
TTCATGTCCGCGAGCACCCC
178bp
GACTCTTCCGCCATCGCTCT
ant(3″)-Ⅰ
TGATTTGCTGGTTACGGTGAC
284bp
CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG
ant(2″)-Ⅰ
GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG
320bp
CTGTTACAACGGACTGGCCGC
qacE△1-sul1
TAGCGAGGGCTTTACTAAGC
300bp
ATTCAGAATGCCGAACACCG
1.5耐药基因亲缘性分析以耐药基因为分子标记作检测结果的聚类分析
2结 果
2.1抗生素敏感性试验结果 见表2。
表2:
37株Pa菌对15种抗菌药物的敏感性
抗菌药物
敏感株数(%)
中敏株数(%)
耐药株数(%)
庆大霉素
16(43.24)
3(8.11)
头孢匹美
25(67.57)
10(27.03)
头孢曲松
5(13.51)
27(72.97)
头孢他啶
18(48.65)
1(2.70)
头孢唑啉
37(100)
妥布霉素
17(45.95)
亚胺培南
21(56.76)
2(5.41)
12(32.43)
左旋氧氟沙星
氨苄西林
34(91.89)
氨苄西林/舒巴坦
33(89.19)
氨曲南
22(59.46)
呋喃妥因
复方新诺明
环丙沙星
哌拉西林/他唑巴坦
19(51.35)
2.2 β内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检测结果 37株Pa菌中发现阳性TEM9株(24.32%)、CARB16株(43.24%)、VIM2株(5.4%)、oprD2基因均缺失32株(86.49%),其余基因均为阴性。
第6号、12号菌株TEM、CARB和VIM基因PCR产物经DNA测序和BLAST比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分别为TEM-1型+CARB-like型+VIM-2型和TEM-1型+CARB-3型。
其中CARBlike型(与CARB-4型基因序列[注册号:
U14749]高度同源,一致率99.4%。
但与已注册CARB各型存在有义突变,本文以CARBlike命名)。
本研究中CARBlike型、VIM-2型基因序列已成功注册GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide,注册号:
DQ309772、DQ077823)。
国内4家医院铜绿假单胞菌β内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检出情况比较见表3。
图1为TEM基因PCR产物电泳图,图2为CARB基因PCR产物电泳图,图3为VIM-2型,图4为6号株TEM、CARB、VIM基因PCR产物测序图。
表3国内四家医院铜绿假单胞菌β内酰胺类抗菌药物耐药基因检出情况
基因
江大附院
湖州98医院[9]
襄樊中心医院[2]
花都医院[10]
9(24.32%)
20(71.43%)
18(51.42%)
18(55.56%)
17(45.95%)
未检测
2(5.41%)
OXA
1(3.57%)
6(17.14%)
1(2.86%)
5(27.78%)
4(22.22%)
OprD2缺失
32(86.49%)
25(89.29%)
35(100%)
3(16.67%)
图1TEM基因PCR电泳图
[M:
分子标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
阳性对照,N:
阴性对照,S:
标本阳性]
图2CARB基因PCR电泳图
图3VIM-2基因PCR电泳图
图4-1TEM基因测序图
图4-2CARB基因测序图
图4-3VIM基因测序图
2.3氨基糖苷类修饰酶基因检测结果37株Pa菌中阳性株为:
aac(6′)-Ⅰ3株(8.11%)、aac(6′)-Ⅱ16株(43.24%)、ant(3″)-Ⅰ7株(18.91%)、ant(2″)-Ⅰ15株(40.54%)其余基因均为阴性。
图5为aac(6′)-Ⅰ基因PCR产物电泳图,图6为ant(2″)-Ⅰ基因PCR产物电泳图。
图5aac(6’)-Ⅰ基因PCR电泳图
分子量标记,由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp,P:
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 医院 感染 铜绿 假单胞菌 抗菌 药物 多重 耐药 基因 研究 论文