分子生物学实验报告正文Word文档格式.docx
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暗培养7天的小麦幼苗(黄化苗),含质粒的大肠杆菌P38
2.2试剂
2.2.1质粒DNA提取
质粒小提试剂盒(天根公司,中国产)
LB液体培养基:
胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,溶解于1000mL蒸馏水中,用NaOH调pH至7.0。
高压灭菌20分钟。
LB平板培养基:
在每1000mLLB液体培养基中中加入15g琼脂,高压灭菌20分钟。
溶液Ⅰ:
50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-Hcl(pH8.0),冰箱保存,RNA酶要提前加入溶液Ⅰ中;
溶液Ⅱ:
0.2mol/LNaOH,1%SDS(碱性的NaOH使蛋白质变性,SDS结合变性的蛋白质);
溶液Ⅲ:
Ph4.8的醋酸钾溶液(5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml);
TE缓冲液(pH8.0):
10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTAl;
无水乙醇和70%乙醇。
2.2.2质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
EcoRⅠ酶(Thermo,美国)λDNA
TBE缓冲液(5×
):
用时需稀释10倍
点样缓冲液Loadingbuffer(10×
0.25%溴酚蓝,40%甘油
溴乙啶(EB):
10mg/ml溴乙啶(注意:
该试剂具致癌作用,用时要小心)琼脂糖1%
2.2.3质粒载体和外源DNA的连接反应
目标DNA片段(P38质粒的PCR扩增产物)
载体(pGEM-TEasy)
2×
ligation缓冲液
T4DNA连接酶
2.2.4感受态细胞的制备及转化
0.1mol/LCaCl2取20μlPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
LB液体培养基
LB固体培养基
氨苄青霉素(100mg/mL)
2.2.5地高辛标记的Southern杂交
1.DIGRandomLabelingMix(高效)(博士德,中国)
2.Anti-DIG-APConjugate
3.BCIP/NBTStockSolution
4.BlockingReagent
5.20×
SSC:
0.3M柠檬酸钠,3MNaCl
6.2×
0.03M柠檬酸钠,0.3MNaCl
7.0.2MEDTA
8.变性液:
0.5NNaOH,1.5MNaCl
9.中和度:
0.5MTris-HCl,pH7.4,3MNaCl
10.Standardbuffer:
5×
SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%BlockingReagent。
11.Standardbuffer+50%formamide
12.Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体
13.BCIP/NBT储备液:
14.冲洗液:
0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.pH=7.5.
15.封闭液:
1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.
16.显色缓冲液:
0.1mMTris-HCl,0.1MNaCl,pH=9.5.
17.TE缓冲液:
10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0
2.2.6RNA分离与纯化
TrizolReagent(Trizol试剂盒)
氯仿,异丙醇,70%乙醇,DEPC(含有RNA灭活酶)处理的ddH2O,溴乙锭(EB)10mg/ml,点样缓冲液Loadingbuffer(10×
)(0.25%溴酚蓝,40%甘油)。
2.2.7RT-PCR扩增目的基因cDNA
RNA模板,cDNA引物,反转录缓冲液,dNTP,MMLV反转录酶(Thermo,美国),RNA抑制剂(RNasin),Taq酶及PCR缓冲液(10×
),引物(P1、P2)。
2.2.8小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析
DNA抽提液(CT-AB)
用时将下述三种溶液按1:
1:
0.4(V/V)比例混匀,加入亚硫酸氢钠(3.8g/L),即为抽提液。
①DNAextraction(500ml):
31.885gsorbitol(山梨醇)
6.05gTrispH8.2(一般不调)
②Nucleilysisbuffer(500ml):
100ml1MTrispH7.5
100ml0.25MEDTA
200ml5MNaCl
10gCTAB
100mlddH2O
③5OOml5%sarkosyl(N-月桂酰肌氨基钠盐)
氯仿:
异戊醇(24:
1)70%乙醇异丙醇HindIII酶EcoRⅠ酶
2.3实验器材
2.3.1质粒DNA提取
Eppendorf管,离心管,10,100.1000微量加样器,台式高速离心机(EppendorfCentrifuge5424R),摇床、高温灭菌锅。
2.3.2质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
电泳仪系统,紫外灯,恒温水浴箱
2.3.3质粒载体和外源DNA的连接反应
低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R),恒温移液器,恒温水浴锅
2.3.4感受态细胞的制备及转化
低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R),平衡天平(UX620H,UniBloc),无菌操作台,微量移液器
2.2.5地高辛标记的Southern
杂交台式低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R),恒温水浴锅,杂交管,玻璃板,砖头,大型皿,电泳系统,硝酸纤维素膜,分子杂交仪(1339,北京宾达英创科技有限公司)
2.3.6RNA分离与纯化
微量加样器,离心管(1.5ml),低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R)
2.3.7RT-PCR扩增目的基因cDNA
PCR扩增(Appliedbiosystemsbylifetechnologies,ABI,美国),电泳仪,低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R),恒温水浴锅
2.3.8小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析
PCR扩增(Appliedbiosystemsbylifetechnologies,ABI,美国)低温离心机(EppendorfCentrifuge5424R),恒温水浴锅,紫外分析仪,微量加样器
2.4实验步骤(略)
2.5实验结果
12345678910111213141516171819202122
图1P38质粒电泳结果
注:
泳道2为质粒提取结果,泳道22为Marker.
图2质粒PCR电泳结果
123456789101112131415161718
泳道11为质粒PCR产物,泳道15为Marker.泳道16为空白(被Marker污染)。
图3质粒P38和EcoR酶切产物对比电泳
1234567891011121314
泳道1为Marker,泳道12为P38质粒,泳道14为酶切产物。
图4菌落PCR
123456789101112131415
2000
500
800
1200
3000
4500
菌落PCR结果条带略小于500.
图5植物RNA提取结果
图中均为小麦RNA
图6小麦RT-PCR电泳结果
均无cDNA扩增产物的条带
图7小麦基因组PCR产物电泳结果
条带在500至800之间,扩增成功。
图8小麦基因组和EcoR酶切对比电泳结果
123456789101112131415161718192021222324
依次从左至右,泳道数奇数为酶切结果,偶数为g-DNA.
图9southern杂交结果
泳道1为P38质粒,泳道2为PCR产物,泳道3为酶切产物。
2.6分析讨论
在感受态细胞转化实验中,结果只出现了极少极少数的蓝斑,可能存在一些假阳性的结果。
原因可能是X-Gal和IPTG量比较少,又是直接混入培养基中的,大部分不能发挥作用。
X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物,在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。
如果将X-Gal和IPTG均匀涂抹于培养基表面,或许效果会明显一些。
图1显示,提取的质粒电泳条带结果表明其分子量大于2000,条带较为清晰。
图2显示,质粒PCR产物分子量在500至750之间。
图3中,泳道6号和7号组切割不完全或有的没有切开。
正确的酶切产物应该只有一条带,且带的位置和质粒条带几乎在同一直线上。
图4显示,菌落PCR的条带分子量在500至800之间。
图5(变性后又常温复性后补照的)显示,提取出来的RNA质量不好,没有明显的18S和28S条带,呈弥散状,降解严重,下图(第一次高压快速跑出的条带
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