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1.納豆的起源
日本人是現今世界上最長壽的民族而受注目,其可能原因之一是他們長期攝取了微生物醱酵釀造食品,例如:
納豆、味噌、酒釀、米麵及其他醃漬類食品。
在這許多醱酵釀造食品中,納豆被認為是維繫日本人健康長壽,深具民族特色的飲食文化之一。
日本關於納豆的歷史相當久遠,據民間的傳說,在繩文時代的木期(約2300年前),大豆由中國大陸進入日本。
他們將大豆煮熟後,使用稻草包起來(稱為苞),使其保持一定的溫度,由於稻草上生長的納豆菌起了作用,充分醱酵後便成為帶有黏性物質與獨特氣味的大豆醱酵食品。
根據歷史文獻公元753年中國唐代高僧鑒真和尚東渡日本傳經時,在其「東征傳」一書裡記載著他攜帶甜鼓三十石到日本,這種甜鼓可能是日本納豆的前身。
在日本有關納豆的紀錄是公元1286年藤原明衡在「新猿樂記」一書中提及納所(寺廟廚房的意思)之豆,第一次出現了「納豆」的名詞,在古代日本豆類是講究持戒時代僧侶們的主要蛋白質攝取來源,所以納豆也稱為「寺納豆」。
而成為一般民眾的普及食品則始於公元1600年左右的江戶時代。
納豆的工業製程如圖1所示,目前在日本的年銷售額已超過1,000億圓。
圖1 納豆食品的製程
2.納豆的神奇功效
納豆食品主要成分含有納豆菌,多種酵素,抗菌物質啶二羧酸(dipicolinicacid),皂角甘(saponin),卯磷脂(lecithin),異黃酮(isoflavone),豐富多樣的維生素(B1,B2,K2),黏蛋白(mucin,γ-PGA),胺基酸以及礦物質。
早在日本江戶時代的「本朝食鑑」,中記載「納豆可以整腸、促進食慾,並可解毒」,因此,納豆是營養豐富並具抑菌功效的醱酵食品。
經過科學研究結果,納豆食品目前在日本被認為在腸胃調整功能方面,具有治療痢疾、感染、腸胃發炎、脹氣、消化不良、便秘、殘便等功效。
此外,在增強心臟與血管能力方面,納豆食品近年來最受矚目的話題是1980年須見洋行教授所發現的溶解血栓的功效。
目前已知其溶解血栓的一種酵素名為納豆激酶(nattokinase)。
日本人平均每日食用100公克(市售納豆2盒)的納豆食品,其中的納豆激酶含量及血栓溶解活性便相當於臨床上使用的尿激酶(urokinase,UK)16萬國際單位(IU)。
因此,已有專業生技公司開發成含有高NK活性的血栓預防保健食品在市場上販售。
此產品適合於不喜歡納豆食品獨特氣味的消費者。
最近的研究報告更指出食用納豆食品亦具有下列保健功效:
納豆含有天然的血管收縮素轉化酵素抑制劑(angiotensinconvertingenzymeinhibitors,ACELs),會阻止血管收縮素被活化,可預防高血壓,含有天然抗氧化成分具有防止老化、動脈硬化及保護肝臟的功效,含有高單位的維生素K2,可預防骨質疏鬆症等功效。
由於這些神奇功效,納豆是深受日本人歡迎的長壽健康養生食品(圖2)。
NATTO
HEALTHYFOODS
圖2.納豆的神奇功效
3.納豆菌
1905年東京大學的 村教授從納豆中純粹分離出納豆菌,並將該菌株命名為BacillusnattoSawamura。
此後於1946年經美國Smith等人的研究,認為納豆菌應屬於枯草桿菌(Bacillussubtilis)的類緣菌(亞種),因此在分類上從Bergey'
sMannualofDeterminativeBacteriology笫6版起,將納豆菌歸屬於枯草桿菌中。
但由於納豆菌的維生素要求性或以γ-PGA為主要成分的粘質物生產特性,以及噬菌體的感染特異性顯然與枯草桿菌不同,故在日本還是與枯草桿菌區別,使用納豆菌的名稱。
納豆菌是不產生毒素和對人體沒有病源性的安全菌株(GRAS)。
自從1934年北海道大學農學部的半 洵教授首次成功的將純粹分離的納豆苗(BacillusnattoNo.1)使用於納豆的商業生產後,至今已知與納豆相關的主要菌種示於表1。
目前納豆食品工廠已經使用機器人來操作,並以電腦做集中管理。
使用分離菌株供應安全的生產納豆外,各研究機構也進行菌種改良,努力開發具有優良功效的納豆。
例如,使用Bacillusnatto與Bacillusmegaterium進行細胞融合(protoplastfusion),開發新型納豆菌種,使能大量生產維生素B12來刺激骨髓紅血球增生(增血)的納豆。
利用亞硝基脈(N-methy-N'
-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)處理宮城野納豆菌(B.nattoMiyagino),篩選出經過長時間醱酵後氨氣產生量較低的變異株,以生產「無臭納豆」供應關西地區市場販賣。
二、血栓溶解酵素-納豆激酶(Nattokinase)
1.納豆激的發現及其特性
1980年須見教授在美國芝加哥大學進行血栓溶解酶pro-UK與UK的構造分析研究時,無意間發現納豆食品含有高濃度的血栓溶解成分。
如圖3所示,直接將納豆放在含有人工血栓的平板(fibrinplate)上,納豆周圍的血栓就溶解了。
圖3納豆菌培養液的人工血栓溶解活性
人工血栓(Fibrinplate)上各添加30μl於37℃反應12小時後的血栓溶解活性
N:
納豆菌培養萃取液(20FU/ml)
U:
尿激酶(100IU/ml)
P:
血纖維蛋白(4CU/ml)
1987年須見教授進一步研究結果,發現在納豆食品的醱酵過程中,納豆苗會產生一種絲胺酸蛋白酶(serineproteinase),經過純化後已知其PI值為8.6±
0.3,分子量為27,728,由275個胺基酸構成的單一鏈結構蛋白質(圖4)。
此酵素在pH值6~12的範圍內具有很強的血纖維蛋白(fibrin)溶解能力,但環境溫度超過60℃時,酵素活性則急速下降。
其溶解血栓能力可能超過目前已知的溶血栓藥物,因此,將納豆與尿激二者名稱加以結合,將納豆食品中含有的血纖維蛋白溶酶(plasmin)命名為納豆激酶。
圖4納豆激酶的分子結構(胺基酸序列)
納豆激主要存在於納豆的粘質物中,具有水溶性,故容易萃取、精製(可利用乙醇沉澱、凝膠層析、離子交換層析的組合方法)。
人體內可直接溶解fibrin的酵素只有plasmin(又稱為fibrinolysin)。
通常血液中含有plasmin的前驅物血纖維蛋白溶酶原(plasminogen),而所謂的纖溶系統酵素是指可以將plasminogen活化成為plasmin的活化劑(plasminogenactivator),包括尿激酶與鏈球菌激酶(streptokinase,SK)等。
具有活性的纖溶系統酵素,如尿激酶、組織血纖維蛋白溶原活化劑(tissueplasminogenactivator,t-PA)與血纖維蛋白溶酶等都含有雙硫(S-S),鍵,可以將分子結構的兩條鏈加以鍵結,且其分子結構的N端都具有能和基質血纖維蛋白結合部位(bindingsite),稱為"
Kringle"
(屬於特殊胺基酸序列),而C端則具有絲胺酸蛋白的反應部位(reactivesitc)。
但納豆激酶為不含有Kringle構造的單一鏈結構,且在分子構型中完全不合雙硫鍵結。
在血栓溶解劑方面,歐美傳統上使用鏈球菌激酶(SK),而日本則使用尿激酶(UK)經靜脈進行注射,後者若以腸溶膠囊包裹給藥,一樣具有療效。
因此,同樣嘗試以腸溶膠囊包裹納豆激酶(NK)給藥,結果發現納豆激酶會緩和的很長時間促進血液中的纖溶亢進現象,血中的t-PA濃度也會同時增加。
t-PA是世界各大藥廠競相開發的第二代血栓溶解藥劑。
由於納豆激不具有t-PA抗原性,其結果顯示,經口服納豆激後,可能會促使血管內皮細胞由來的血纖維溶解酶(如endogenous的plasminogenactivator)產量增加。
血栓的形成、分解與納豆激酶的作用方式示於圖5。
由於口服納豆激酶可以活化體內的纖溶系統酵素,具有提升人體血纖維分解的能力,並獲得臨床上的功效證實。
此外,相較於尿激在體內的半衰期為20分鐘,納豆激酶在體內可存在長達2小時,且不具溶血等副作用,是具有發展為新型的血栓溶解劑。
目前在日本納豆激酶已成為上市的機能性健康食品。
圖5血栓的形成、分解與納豆激酶的作用方式
血栓的形成:
凝血酶原(protrombin)受促凝血酶原激酶(thromboplastin)的作用成為凝血酶(thrombin),而血纖維蛋白原(fibrnogen)受凝血酶的作用生成血栓(fibrin)。
納豆激酶的血栓分解作用
A直接分解血栓
B活化proUK成為UK
C增加t-PA產量
2.納豆激酶的醱酵生產
為了建立納豆激酶的液態醱酵生產程序,以提供在國內進行工業化生產的依據,筆者等自2002年3月起以一年的時間在台灣大學農化系醱酵化學研究室完成下列研發工作。
(1)NK酵素活性測定方法的建立
A.使用合成發色基質S-2251測定NK活性的方法(SyntheticsubstrateS-2251method)
〔原理〕
NK會將發色性合成基質S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)加水分解而游離出p-nitroaniline(pNA)。
於波長405nm比色定量測定NK活性。
B.利用紫外線(275nm)測定血栓(Fibrin)分解產物的吸光度,以測定NK活性的方法(Fibrin-digestionmethod)
此方法是利用thrombin將fibrinogen活化形成fibrin,再添加待測試料進行fibrin分解。
所增加的酸可溶性低分子分解產物量,以紫外線(275nm)測定吸光度,算出NK活性。
圖6Fibrinolyticactivityassay
(diameterofclearzone)
(2)NK高生產力菌株的篩選
使用含有大豆蛋白的液態培養基三角搖瓶,於一定培養期間分別測定苗體量與培養液及菌體內所含NK活性。
NK活性的測定是採用血纖維蛋白平板法(fibrin-platemethod),依分解fibrin所造成的透明圈面積的大小來定量NK活性的強弱。
試驗結果從收集所得的納豆菌17株中,篩選出NK高生產力、高外泌性的菌株BacillusnattoMiura。
(3)最高生產用培養基與培養條件的探討
使用前述NK高生產力、高外泌性菌株,於三角搖瓶中分別檢討培養基的主要成分(碳源、氮原、磷源、無機鹽、金屬離子等),與大豆蛋白含量,及碳氮比(C/Nratio)對NK生產力的影響。
並於小型醱酵槽中探討攪拌速率及通氣量及pH控制對NK生產力的影響。
此外,由於生長過程中納豆菌亦會產生黏稠性物質-聚麩胺酸(poly-γ-glutamicacid,γ-PGA),應同時考慮能夠降低PGA產量的生產條件,以利NK的分離回收與精製等後續程序。
最適化條件探討完成後,便進行5L醱酵槽培養,以獲得菌體增殖與NK生產等參數。
所得參數作為醱酵槽放大培養試驗的參考。
5L醱酵槽中裝入2L基礎培養基(basalmedium),在pH-stat控制下追加1L儲料培養基(feedingmedium),培養48-hr後,NK活性可達900~1,100FU/ml。
B
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