分子生物学实验指导文档格式.docx
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100~1:
50转接于100mlLB培养基中,37℃振荡培养2~3h(OD600约0.2~0.4)。
(2).将菌液冰浴10min后,转入离心管中,于4℃离心4000rpm,10min,去上清,收集菌体。
(3).用10ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细胞,冰浴15~30min。
(4).0~4℃,离心4000rpm,10min。
(5).弃上清液,每50ml初始培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置30min。
(6).制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置24h内直接用于转化实验,也可加入1/10高压灭菌甘油,置-70℃冻存。
2.感受态(JM109)转化鉴定(无菌操作)
1.取感受态细菌100μl,加入pUC18(或pBR322)质粒(0.3mg/ml)10ul混匀。
2.冰浴30min后,42℃水浴热休克2min,再于冰浴2min,加入LB液体培养基0.5ml,37℃振荡培养40min。
3.分别取菌液30~100ul加到含Amp的LB固体培养基平皿上,用三角玻璃刮刀铺板室温放置2min,然后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜,观察是否有菌落。
4.结果分析:
在培养基平板上应可以观察到转化子形成的菌落。
【实验准备】
1.LB培养基取胰蛋白胨2g,酵母提取物1g,氯化钠2g,加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0,定容至200mL,高压灭菌。
2.固体培养基取胰蛋白胨2g,酵母提取物1g,氯化钠2g,琼脂粉1.2g,加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0,定容至200mL,高压灭菌。
临用前将固体培养基融化后倒入平皿中,待凝固后备用。
3.0.1mol/LCaCl2取CaCl21.11克加双蒸水定溶至100mL,然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
【注意事项】
1.实验中所用的器皿均要灭菌,以防止杂菌和外源DNA的污染。
2.实验过程中要注意无菌操作,溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。
3.应收获对数生长期的细胞用于制备感受态,OD600不应高于0.6。
4.制备感受态细胞所用试剂如CaCl2等的质量要好。
5.整个实验一定要在冰浴条件下操作,温度时高时低会影响转化效率。
6.42℃热处理很关键,温度要准确,转移速度要快。
【思考题】
1.何谓感受态细胞?
2.制备感受态细胞时需注意什么?
实验2DNA的转化及阳性克隆的筛选
学习DNA体外重组技术及转化方法
了解蓝白斑实验筛选转化子的原理和方法。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一,其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下,DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5´
端磷酸和3´
端羟基之间相互作用,形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低,能更有效地连接DNA的平末端,应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子,在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
体外连接的重组DNA分子必须导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
本实验利用pUC18作为载体,经T4DNA连接酶作用,将外源基因插入其多克隆位点,构建重组质粒,转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,利用蓝白斑实验筛选出转化子。
(1)将冻存的感受态细胞置于冰上,缓慢解冻;
(2)加入待转化的质粒DNA,轻轻混匀,冰浴30min;
(3)42℃热激90s;
(4)立即置冰上5min;
(5)加入无抗性的800μlLB液体培养基,37℃缓慢震荡活化1h到1.5h;
(6)活化好的菌体室温5000r/min,5min离心;
(7)弃上清,用200μl没有抗性的LB液体培养基吹打悬浮菌体,蓝白筛选时,向悬浮的菌液中加入16μl50mg/mLIPTG和40μl20mg/mLX-gal;
然后将全部液体涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上;
超净工作台上,将培养皿口半开,等培养基表面的液体完全蒸发后再完全盖好培养皿;
(8)37℃倒置培养至菌体适当大小时,大约12-16h,再进行下一步实验。
1.载体DNA,外源DNA
2.T4DNA连接酶
3.10×
T4DNA连接酶缓冲液
4.感受态细菌
5.LB液体培养基
6.LB固体培养基平皿(含amp)
7.X-gal
8.IPTG
1.根据具体情况调节酶的用量。
平端连接效率比粘端连接低得多,因而应加大酶的用量。
2.正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。
一般外源DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3~10倍。
实验3DNA的限制性酶切反应
掌握DNA限制性内切酶酶切的基本原理。
限制性内切酶能特异地识别、结合于一段被称为限制性酶序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类,其中Ⅱ类限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA技术的基本工具酶。
绝大多数Ⅱ类限制酶可识别长度为4至6个核苷酸的回文序列,其切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割双链DNA,产生平末端的DNA片段;
有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。
1)以鉴定为目的的酶切
在无菌的1.5mLEppendorf管中加入:
10×
buffer1μl
质粒DNA1μl
限制性内切酶0.2μl(10U/μl)
加入ddH2O至总体积10μl
37℃温育2-4h,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,注意:
质粒是以1.5mL菌液所提质粒用10μlddH2O溶解所得的。
2)以回收酶切产物为目的的酶切
在无菌的1.5mLEppendorf管中加入:
buffer5μl
质粒DNA3-10μl
限制性内切酶1-2μl(10U/μl)
加入ddH2O至总体积50μl
37℃温育过夜,通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
1.pBS-T质粒
2.HindⅢ酶及其酶切缓冲液
3.EcoRI酶及其酶切缓冲液
(1)限制性内切酶需保存于-20℃,操作时应将酶保持在冰浴中,避免长时间置于高温中。
(2)在酶切反应中,应最后加入酶,尽量减少室温接触机会。
(3)加样时吸头垂直进入试剂管,避免碰到管壁,加酶时吸头深入不可过深。
每加完一样要换一个吸头,同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加,避免污染。
(4)注意酶的用量,加入的酶量按1-3U/ugDNA计算,酶的体积应低于反应总体积的10%,以避免酶液中甘油干扰反应。
酶量过大时,有产生星号活性的可能,即在识别序列以外的位点进行切割。
(5)酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。
1.酶切时应注意什么?
2.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,可能是什么原因?
蓝白筛选的原理
实验材料介绍
1)载体质粒和转化受体菌株:
实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E.coliDH5α菌株。
E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。
载体质粒DNApBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。
(这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。
)
在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。
但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
2)实验用显色方法
实验中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖。
X-gal以及β-半乳糖均为β-半乳糖苷酶底物,但是X-gal不能诱导β-半乳糖苷酶操纵子。
实验中使用IPTG以诱导β-半乳糖苷酶操纵子。
X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物。
实验原理
1)初步筛选
载体质粒DNApBS上带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;
而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。
此为初步的抗性筛选。
2)蓝白筛选
当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
而没有重组质粒的转化子产生α-互补,在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
实验干扰
在实际操作中,蓝白筛选出现是浅蓝色重组子的原因是:
插入小片段时,质粒仍可以表达有缺陷N-末端a肽与B连互补形成活力有缺陷的半乳糖苷酶重组子形成浅蓝斑。
即而出现假阴性。
实验4植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,
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- 分子生物学 实验 指导