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⏹(五)凝胶过滤法测定相对分子量
三、蛋白质胶体性质和蛋白质的沉淀
⏹
(一)胶体性质
⏹分散质点在1~100nm范围内
⏹蛋白质是一种亲水胶体,分子表面的亲水基在水中起水化作用,蛋白质在适当条件下可带相同的正电荷,与周围的反离子构成双电层,蛋白质作为胶体稳定,无外界影响,就不互相聚集而沉淀
⏹
(二)蛋白质的沉淀现象
⏹1、盐析法:
中性盐使蛋白质脱去水化层而凝聚沉淀。
⏹2、有机溶剂沉淀:
甲醛、乙醇、丙酮
引起蛋白质脱去水化层,降低介电常数,增加质点间的相互作用引起沉淀。
⏹3、重金属盐沉淀:
大于等电点时,蛋白质颗粒带负电荷,容易与金属离子形成不溶性的盐。
⏹误服重金属盐的病人可以口服大量的牛乳和豆浆等蛋白质进行了解救
⏹它能和重金属离子形成不溶性盐,再服催吐剂排出体外。
⏹4、生物碱类沉淀蛋白质
PH<
PI蛋白质带正电荷,容易与生物碱试剂生成盐类沉淀
生物碱试剂指引起生物碱沉淀的一类试剂如单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸。
⏹5、加热变性沉淀法
加热使蛋白质天然结构解体,疏水基外露,破坏水化层;
少量盐可以加速蛋白质凝固,如豆腐制作工艺
四、蛋白质分离纯化的一般原则
⏹1、生物材料的前处理
分离纯化蛋白质,首先将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放出来,并保持原来的天然状态和生物活性,常用的方法有以下几类:
⏹(1)机械破碎法:
利用机械剪切作用,将细胞研碎。
如玻璃匀浆器、组织捣碎机、研钵等。
⏹(2)渗透破碎法:
利用低渗使细胞溶胀破碎。
例如将红细胞放入水中便发生自溶。
⏹(3)交替冻融:
将生物组织冻结后,细胞内容物使细胞涨破。
⏹(4)超声波法:
超声振荡,使细胞膜上受张力不均匀而解体。
⏹(5)酶消化:
利用蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶等对细胞壁和膜的分解作用使他们解体。
⏹2、粗分级
处理量大,既能除杂质,又能浓缩
盐析、超过滤、凝胶过滤、冷冻干燥等方法
⏹3、细分级
规模较小,但分辨率高,如采取层析和电泳等方法。
五、蛋白质混合物的分离方法
⏹依据:
分子的大小;
溶解度;
电荷;
吸附性;
对其它生物分子的亲和力。
(一)根据分子大小不同的和分离法:
⏹1、透析和超过滤原理:
利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
⏹常用的半透膜是玻璃纸和火棉和其它合成材料。
⏹透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中放在蒸馏水中进行
⏹透析外液可以更换,直到透析袋里无机盐等小分子物质降低到最小值为止。
⏹超过滤是利用压力和离心力,强行使其它小分子和水通过半透膜,而蛋白质留在膜上。
⏹透析:
古老方法、时间长
⏹超过滤:
高级,较重要
2、离心
⏹蛋白质分子颗粒的沉降取决于其分子大小,如:
差速离心。
3、密度梯度离心:
⏹蛋白质分子颗粒的沉降不仅取决于它的大小,而且决定与它的密度。
⏹如果蛋白质在具有密度梯度的介质中离心,质量密度大的颗粒比质量密度小的颗粒沉降的快。
⏹并且每一种蛋白质颗粒沉降,与自身密度相等的介质梯度时,即停止不前。
⏹最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区段。
⏹生成的区段可在底部刺一个小孔处地方流出,分部收集,每个组份进行小样分析以已确定取代的位置。
⏹核酸分离用得多,常规用得不多。
4、凝胶过滤的原理:
⏹当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构,排阻在凝胶珠以外,随着溶剂在凝胶球间隙中向下移动并最先流出柱外,比孔径小的分子不同程度地进入凝胶珠内外。
这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。
⏹大分子先被洗脱下来,小分子物质后被洗脱来
(二)利用溶解度差别的分离方法:
⏹影响蛋白质溶解度的外界因素有溶液的pH值离子强度、介电常数、温度。
⏹在同一的特定的外界条件下,不同的蛋白质具有不同的溶解度,这取决于它本身的结构,如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团疏水基团的比例及其排列方式。
⏹根据蛋白质分子的结构特点适当改变外界条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。
⏹1等电点沉淀:
蛋白质分子是两性电解质,带电的基团电荷数量因为pH不同而变化。
⏹当蛋白质处于等电点时,蛋白质在静电荷为零,由于相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于结聚而沉淀,因此它的溶解度达到最低点。
⏹不同蛋白质具有不同的等电点,当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来
⏹那些高于或低于pI的蛋白质仍留在溶液中。
⏹这种等电点沉淀的蛋白质保持着天然构象,能重新溶于适当pH和一定浓度盐溶液中。
2、盐析与盐溶
⏹低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶。
⏹盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电表层使蛋白质彼此排斥,蛋白质及水分子的作用加强,因而溶解度提高。
⏹球蛋白在透析中往往沉淀而析出,自是因为出去了盐类离子,使蛋白质分子间的相互吸引增加,引起蛋白质分子引起而沉淀。
⏹当溶液的离子强度增加到一定数值时,蛋白质溶解度开始下降。
⏹当离子强度增加,足够高时,例如饱和或半饱和度程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。
⏹盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水,从而降低蛋白质极性基团于水分子间的相互作用,破坏蛋白质分子表面的水化层。
⏹例如:
鸡蛋清用水稀释后,加入硫酸铵半饱和,球蛋白析出,过滤后,酸化至pH4.6-4.8既得卵清蛋白晶体。
3有机溶剂分级沉淀
⏹与水互溶的有机溶剂(甲醛、乙醇和丙酮)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。
⏹室温下有机溶剂还可引起变性,如果预先将有机溶剂进行冷却,然后再不断搅拌下逐渐滴加已防止局部浓度过高,可以避免变性。
⏹有机溶剂能使蛋白质沉淀的原因可能有两方面:
(1)溶液介电常数降低,降低了蛋白质分子间的斥力;
(2)同盐析相似,有机溶剂与蛋白质分子争夺水化层的水,使蛋白质聚集而沉淀。
4、利用温度对蛋白质溶解度影响
⏹在一定温度范围内,球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。
⏹超过一定范围。
大部分蛋白质变得不稳定开始变性。
⏹大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质分离操作一般在0℃或更低的温度下进行。
(三)根据电荷不同的分类方法:
⏹1、电泳法
⏹
(1)自由电泳:
U型管内蛋白质溶液和缓冲液之间有清晰可见的界面,然后加一电场。
⏹由于界面处存在浓度的梯度因而产生折射率梯度。
利用适当的光学系统可以观察到界面的移动。
⏹在电泳过程中,每个移动的界面相当于某一特定的蛋白质,通过一定的计算可得出其泳动度。
⏹
(2)区带电泳:
在支持物上电泳时蛋白质混合物被分成若干区带。
⏹根据支持物物理性质不同可分为4类
滤纸电泳和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。
常用滤纸和凝胶电泳。
⏹(3)聚丙烯酰胺电泳(盘状电泳):
以聚丙烯酰胺为支持物,制成凝胶柱,
⏹凝胶柱由两节凝胶组成(小节浓缩胶、大节分离胶)
⏹这二段胶的孔径大小、缓冲液组分、离子强度、pH值、电场强度都是不同的。
。
⏹电泳时,样品被压缩成一个薄层,然后进行电泳。
⏹电泳过程有三个效应:
样品浓缩效应、凝胶对分离分子筛分效益、电泳分离的电荷效应。
⏹使样品分离效果好,分辨率高。
⏹3、离子交换层析
⏹支持物主要有两类:
离子交换纤维素、离子交换葡聚糖
⏹特点:
网状结构,有较大的表面积,大分子可以通过;
既能根据净电荷数量又能根据分子大小进行分离。
⏹蛋白质混合物的分离可以通过改变溶液中的盐离子强度和pH值来完成,对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。
(四)利用选择性吸附的纯化:
⏹蛋白质分子通过次级键的相互作用能吸附在某些吸附剂上,由于不同分子的吸附能力不同,可以通过洗脱使他们逐步解脱下来。
⏹某些物质,例如极性的硅胶、氧化铝以及非极性的活性碳粉末具有吸附能力,可将其它分子吸附在其颗粒的表面而吸附能力强弱又因物质性质的不同而异,
⏹利用这种吸附能力的差别可以使其达到分离的目的。
⏹1、羟磷灰石层析(结晶羧磷酸钙)
例如:
结晶磷酸钙中的钙可以同蛋白质中负电荷的基团结合,蛋白质可用磷酸缓冲液从羟磷灰石柱上洗脱下来。
⏹2、疏水作用层析
根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的纯化技术。
⏹
(1)原理:
在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂。
⏹利用载体和样品疏水集团的相互作用使他们吸附在一起,然后改变层析条件,减弱疏水作用,使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
⏹
(2)影响疏水作用的因素
⏹1、蛋白质疏水性:
不同蛋白质的疏水区和亲水口袋数目、大小、形状、亲脂性不同。
⏹2、蛋白质的环境:
在水相中提高中性盐浓度或降低乙二醇的浓度,可增强疏水作用。
(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
⏹亲和层析:
分离蛋白质去有效方法。
一般只经一步处理即可使待提纯的蛋白质从复杂的混合物中分离出来。
⏹此方法是根据蛋白质生物学特性及其分子能与另一种称为配基的分子特异非共价结合。
⏹所谓配基是指被大分子蛋白质识别并与之结合原子、原子团和分子。
⏹比如激素和受体、抗原抗体互为配基。
⏹原理:
先把某一种蛋白质特异配基,通过化学反应连接到琼脂糖凝胶的表面功能基,
⏹这类多糖材料允许蛋白质自由通过。
⏹当待纯化的蛋白质样品加到这种糖材料的层析柱时,待提纯的蛋白质与特异配体结合吸附到配体的载体上。
⏹其他的蛋白质,因对整个配体不具结合位点,加上通过柱子流出。
⏹被结合在柱子上的蛋白质可用洗脱液洗脱下来。
(六)高效液相层析和快速蛋白液相层析
⏹高效液相层析是在高压条件下进行,数分钟即可完成,一次分离。
⏹快速液相蛋白层析专用于蛋白分离。
六、氨基酸的分离
⏹利用AA混合物中各组份的物理、化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在互不相溶的两相中,其中一相固定称为固定相,另一相流动称为流动相,使各组份以不同的速度移动,从而达到分离。
⏹分配定律:
当一种溶质在两个互不相涪的溶剂中分配时,在一定的温度下达到平衡后,溶质在二相的浓度比值为一常数,即为分配常数。
(一)纸层析
⏹纤维素吸附的水是固定相,展层用的有机溶剂是流动相、层析时混合氨基酸在这两相中不断分配,使他们分布在滤纸的不同位置上。
⏹此项技术可用于氨基酸成分的定量定性测定。
⏹操作:
点样、展层、显色
用茚三酮显色时得到一滤纸层析色谱。
⏹定义(Rf):
原点到氨基酸层析点距离与原点至溶剂前沿之比称为Rf值。
⏹只要把溶剂系统、温度、滤
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- 第六 蛋白质 重要 性质
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