确认完稿ATP荧光法在乳制品行业的应用研究报告Word格式文档下载.docx
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绪论………………………………………………………………………………………5
1.研究思路………………………………………………………………………………6
2.研究方案………………………………………………………………………………6
2.1牛奶原液总菌数的’检测……………………………………………………………6
2.1.1牛奶原液总菌数检测的’目的’……………………………………………………6
2.1.2牛奶原液总菌数检测的’步骤……………………………………………………6
2.1.3结果分析…………………………………………………………………………8
2.2牛奶原液加菌后总菌数的’测定……………………………………………………8
2.2.1牛奶原液加菌后总菌数测定的’目的’……………………………………………8
2.2.2牛奶原液加菌后总菌数测定的’步骤……………………………………………8
2.2.3结果分析…………………………………………………………………………9
2.3ATP荧光法预处理方法的’选择……………………………………………………10
2.3.1ATP荧光法预处理方法选择的’目的’……………………………………………10
2.3.2ATP荧光法预处理方法选择的’步骤……………………………………………10
2.3.3结果分析…………………………………………………………………………11
2.4ATP荧光法稀释液的’选择…………………………………………………………14
2.4.1ATP荧光法稀释液选择的’目的’…………………………………………………14
2.4.2ATP荧光法稀释液选择的’步骤…………………………………………………14
2.4.3结果分析…………………………………………………………………………15
2.5ATP荧光法和平板菌落计数法之间的’对应关系…………………………………18
2.5.1得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的’目的’…………………………19
2.5.2得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的’步骤…………………………19
2.5.3结果分析…………………………………………………………………………20
2.6结论…………………………………………………………………………………21
3.关于ATP荧光法在乳制品行业的’应用展望…………………………………………22
致谢………………………………………………………………………………………24
参考文献…………………………………………………………………………………25
附录一……………………………………………………………………………………27
附录二……………………………………………………………………………………27
附录三……………………………………………………………………………………27
绪论
细菌总数作为判定食品被细菌污染程度的’标记,具有重要的’卫生学意义..液态生物制品如液态牛奶、低酒精度饮料酒等出厂前都需要经过食品卫生微生物学检验,达到相应的’国标要求才能进入市场..食品细菌学检验通常采用琼脂平板菌落计数法,该方法是根据每个活菌都可生长为一个菌落的’原理设计,这种方法精度高,但是操作过程一般需要2-3的’时间甚至更长,检验结果往往滞后..众所周知,许多食品在生产当天就必须出售,因此急需即时性的’细菌学检验方法..近年来,国外普遍采用HACCP(食品制造过程中卫生管理认证)制度,更迫切需要在食品制造过程中能快速、简便检测食品生产环境清洁度和食品是否达到卫生标准的’方法..ATP生物荧光法作为一种简便、快速的’微生物检验方法,近年来在国外备受瞩目,并得以广泛应用..
ATP作为生物代谢的’能量来源,是微生物不可缺少的’物质..如果捡样中污染了微生物,用有机溶剂等专用试剂破菌后,ATP就被释放出,利用ATP生物荧光法即可测出ATP的’含量..由于活的’微生物体内的’ATP浓度基本稳定,使得ATP浓度与活的’微生物之间存在线性关系,故ATP含量可以成为活的’微生物的’检测指标..
本课题以巴氏灭菌奶为检测对象,进行琼脂平板计数和ATP荧光法两种微生物检测方法,然后将两种方法的’结果进行比较,得到二者之间的’相关性,探索如何对牛奶进行预处理才可以使得ATP生物荧光法代替传统的’平板菌落计数法进行牛奶中总菌数的’测定..由于捡样中游离ATP的’存在,所以我们应该探索最优的’预处理方法,尽量减少游离ATP以及其他杂质对检测结果的’干扰,然后得到传统平板菌落计数法和ATP生物荧光法的’较高相关性,绘制标准曲线,可直接将ATP生物荧光法应用于牛奶中微生物活性的’快速检测,缩短微生物的’检测周期..
1.研究思路
将现有的’牛奶样品浓度梯度稀释后采用传统的’平板菌落计数法进行计数,并用ATP生物荧光检测仪测出不同浓度的’牛奶样液的’荧光值,即可做出活菌总数和荧光值的’对应曲线,并将其作为ATP生物荧光检测仪检测牛奶中总菌数的’标准曲线..
我们在实验中使用的’样品是光明优倍鲜牛奶(市面销售的’巴氏灭菌奶),能在市面上出售的’巴氏灭菌奶应为合格产品,那么,可能出现总菌数过少导致有传统法测出的’菌落总数不准或者根本无法测出..为了避免这种情况的’出现,我们在实验过程中,人为添加大肠杆菌,提高牛奶样液中的’含菌量,再进行实验..
纯牛奶中各类营养物质含量丰富,则有可能会影响ATP生物荧光检测仪的’检测结果,需要我们对牛奶样液进行一定的’预处理;
但是,我们还不清楚牛奶中的’营养物质会对检测造成何种影响..所以,我们先暂定两种预处理方法:
过滤和稀释..若牛奶中的’营养物质对荧光仪的’检测影响较大,过滤可以除去牛奶中的’大分子蛋白质,降低营养物质对检测的’影响;
若牛奶中的’营养物质对荧光仪的’检测影响不大,那么,采用稀释的’方法,不需要复杂的’预处理,简便省时..确定了预处理方案后,稀释液的’选择也需要谨慎的’选择,实验室条件有限,我们暂定稀释液为无菌水和缓冲液..在得到最优的’预处理方案后,做出荧光值和菌数的’对应曲线,得到相关系数..
2.研究方案
2.1牛奶原液总菌数的’检测
2.1.1牛奶原液总菌数检测的’目的’
为了确定市面上销售的’巴氏灭菌奶的’灭菌效果和之后的’实验是否要采用加菌的’办法得到较好的’实验结果,我们首先采用平板菌落计数法检测牛奶原液中的’总菌数,以便确定之后的’实验方案..
2.1.2牛奶原液总菌数检测的’步骤
(1)设备
SPX-250型恒温培养箱;
YX-4502高压灭菌锅;
SW-CJ-ID型单人超净工作台;
250ml锥形瓶(2个);
玻璃试管(6只);
试管架;
培养皿(18个);
小烧杯;
10ml移液管;
微量移液枪及一盒吸头;
酒精灯;
(2)试剂
营养琼脂粉;
盒装牛奶;
(3)步骤
①培养基的’配制;
(详细方法见附录一);
将六只试管中均用10ml移液管加入9ml的’蒸馏水,用盖子盖好;
18个培养皿装盒,一盒吸头用报纸包好,然后把两瓶培养基、6只试管、2盒培养皿、一盒吸头放入高压蒸汽灭菌内灭菌(121℃,20min);
②样品的’稀释
待所有灭菌过的’器具冷却后,用移液枪吸取吸牛奶原液1ml加入有9ml无菌水的’无菌试管内,盖好盖子后将其震荡至混匀(大约5min左右),制成1:
10的’样品匀液;
用1ml微量移液枪吸取1:
10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的’无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管使其混合均匀,制成1:
100的’样品匀液;
重复上述步骤,制备10倍系列稀释样品匀液..每递增稀释一次,换用1次吸头;
③倾注法到平皿
选择2个~3个适宜稀释度的’样品匀液(液体样品可包括原液),吸取1ml样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做三个平皿..同时,分别吸取1ml空白稀释液加入三个无菌平皿内作空白对照;
及时将15ml~20ml冷却至46℃的’平板计数琼脂培养基倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀;
④培养
等到培养皿内的’琼脂凝固后,将平板倒置,在37℃±
1℃培养箱中培养48h±
3h;
⑤菌落计数要求
用肉眼观察,必要时可以用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的’菌落数量..菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示..
选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的’平板计数菌落总数..低于30CFU的’平板记录具体菌落数,大于300CFU的’可记录为多不可计..每个稀释度的’菌落数应采用两个平板的’平均数..
其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的’平板作为该稀释度的’菌落数;
若片状菌落不到平板的’一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数..
当平板上出现菌落间无明显界线的’链状生长时,将每条单链作为一个菌落计数;
2.1.3结果分析
平板上的’菌落生长状况并不理想,甚至有些平皿中并未长出菌落..具体情况见下表..
表一
稀释倍数
10
100
1000
10000
CFU
24/16/28
5/1/7
0/1/0
0/0/0
计算得,总菌数=;
结论:
部分平皿并未长出菌落,并且长出菌落的’平皿都未达到计数要求,这证明巴氏灭菌奶中总菌数过少,为了之后的’实验结果尽可能的’准确,我们需要向牛奶中添加大肠杆菌..
2.2牛奶原液加菌后总菌数的’测定
2.2.1牛奶原液加菌后总菌数的’测定的’目的’
为了保证样液可以用传统平板菌落计数法计数,并达到有效计数范围;
这样才能使ATP生物荧光法的’计数和传统平板菌落计数法更好的’对应起来..
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