常用溶液配方Word文档下载推荐.docx
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另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
A液:
蒸馏水400ml
B液:
Na2HPO42H2O16.88g
蒸馏水300ml
C液:
NaOH3.86g
蒸馏水200m
A液最好在500ml的三角烧瓶中配制(方法同前),至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后,将B液倒入C液中,
混合后再加入A液,以1nNaOH或1NHCl将pH调至7.2〜7.4,最后,补充蒸馏水至1000ml充分混合,4C冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5%〜1%该固定剂较温和,适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中,4C冰箱保
存数月仍可获得满意的染色效果。
3.Bouin'
s液及改良Bouin'
s液
饱和苦味酸
250ml
40%甲醛
冰醋酸50ml
先将饱苦味酸过滤,加入甲醛(有沉淀者禁用),最后加入冰醋酸,混合后存于4C冰
箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin'
s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一,对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整。
但因偏
酸(pH为3〜3.5),对抗原有一定损害,且组织收缩较明显,故不适于组织标本的长期保存。
此外,操作时,应避免吸入或与皮肤接触。
4.Zamboni'
s(Stefanini
'
s)液
多聚甲醛
20g
150ml
Karasson-Schwlt'
sPB
至1000ml
称取多聚甲醛20g,加入饱和苦味酸150ml,加热至60C左右,持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后,加Karasson-Schwlt'
sPB至1000ml充分混合(Karasson-Schwlts磷酸缓冲液的配制配制方法见后)。
该固定液适于电镜免疫细胞化学,对超微结构的保存较纯甲醛为优,也适于光镜免疫细胞化学研究,为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中,常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸,以增加其对组织的穿透力和固定效果,保存更多的组织抗原。
固定时间为6〜18h。
5.PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液(Periodate-Lysine-paraform-alde—hyde
fixative)
过碘酸钠
赖氨酸盐酸盐(或盐酸赖氨酸):
蒸馏水
(1)贮存液A(0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/lNa3PO4,pH7.4:
称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中,得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液,然后加入Na2HPO至0.1mol/L,将pH调至7.4,补足
0.1mol/L的PB至100ml,使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4C冰箱保存,最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOsmmol/L/kg。
(2)贮存液B(8%多聚甲醛溶液):
称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中,配成8^多聚甲醛液(方法见前)。
过滤后4C冰箱保存。
(3)临用前,以3份A液与1份B液混合,再加入结晶过碘酸钠(NaIO4),使NaIO4终浓度为2%由于AB两液混合,pH从约7.5降至6.2,故固定时不需再调pH值。
固定时间为6〜18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基,通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合,从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成,抗原决定簇位于蛋白部分,故该固定剂有选择性地使糖类固定,这样既稳定了抗原,又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为,最佳的混合是:
含
0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6.Karnovskys液(pH7.3)
多聚甲醛30g
25%戊二醛80ml
0.1mol/LPB至1000ml
先将多聚甲醛溶于0.1mol/LPB中,再加入戊二醛,最后加0.1mol/L的PB至1000ml,混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学,用该固定液在4C短时固定,比在较低浓度的戊二醛中长时间固
定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定,接着浸泡固定10〜30min,用缓冲
液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7.0.4%对苯醌(Parabenzoquinone)
对苯醌4.0g
0.01mol/LPBS1000ml
称取4.0g对苯溶于1000ml0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用,但对超微结构的保存有一定影响,故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制,且避免加热助溶,因加热或放置时间过长,固定液变为棕色至褐色,会使组织标本背景增加,影响观察。
此外,对苯醌有剧毒,使用时避免吸入或与皮肤接触。
8.PFG®
(Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative,PFG)
对苯醌20g
多聚甲醛15g
25%戊二醛40ml
0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml
先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛,然后加入戊二醛,最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用,即可阻止醛基对抗原的损害,又不影响超微结构的保存,故适于多种类抗原的免疫细胞化学,尤其是免疫电镜的研究。
9.碳二亚酰胺-戊二醛(ECD-G液
Tris
约14g
浓HCl
少许
ECD
10g
25%戊二醛
3.5ml
0.01mol/LPBS
500ml
先以约500ml的PB与相同体积的PBS昆合,加入Tris(使其终浓度为1.4%)溶解,以浓HCI调pH至7.0,再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液,振摇后计时,用pH计检测,约2〜3min时,pH降至6.6,再以1N的NaOHfc4min内调pH至7.0,此时,将该混合固定液加入盛有细胞(经
PBS漂洗过)的器皿中,在23C固定7min后,以PBS洗去固定液,即可进一步处理
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi—imide
hydrochloride],简称乙基-CDI,常用于多肽类激素的固定,对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD
单独应用时,边缘固定效应重,但与戊二醛、Tris及PB联合应用,效果明显改善,细胞质仍可渗透,利用细胞中抗原的定位,超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10.四氧化锇(锇酸OsmicAcid,OsO4)
配制:
将洗净装有OsO4的安瓿中加热后,迅速投入装有溶剂的棕色瓶中,使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕,洗净后再放入瓶中,盖好瓶塞,用力撞击安瓿,待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解,应在用前几天配制。
(1)2%OsO4水溶解:
取OsO41g容于重蒸水中。
此液常作为储备液,于冰箱中密封保存。
(2)
(2)1%OsO4-PB:
D、OsO40.5g
先分别配好A、B、C三种液体,取A液41.5ml与B液8.5ml混合,将pH调至7.3〜7.4,取A—B混合液45ml再与5mlC液混合即为0.12mol/LPBG。
(3)1%OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.2〜7.4):
2%OsO4水溶液10ml
0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.2〜7.4)10ml
取2%OsO储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2〜7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即
OsO4是电镜研究所必需的试剂,常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂,但也可与肽类及蛋
白质起作用,形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后,电子密度增高,适于电镜研究。
但由于OsO4勺反应产物对光及电子有较明显的吸收能力,因此在免疫细胞化学染色前常需去除,去锇在光镜水平常用1%勺高锰酸钾,在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多,如70%-90%勺酒精、
丙酮、醋酸酒精(含0.1%〜1%昔酸的70%-90%勺酒精等),这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液,但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时,也可试用。
总之,掌握一个原则,免疫细胞化学中,含重金属的固定液禁用(但Zenker-Formalin可进行短时的固定)。
目前多数认为,对生物标本较好的固定措施是:
用4C的Karnovskys液灌注固定10〜30min后,接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液,这种短时冷固定处理,有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFGPLP及Zamboni'
s液等混合固定液。
二、缓冲液
免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多,即使是同种缓冲液,其浓度、pH、离子强度等也常常不同。
在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。
1.0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffer,PB)
NaH2PO42H2O
Na2HPO412H2O
配制时,常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO,4两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PB,根据需要可配制不同浓度的PB和PBS
(1)0.2mol/L的Na2HPO4称取Na2HPO4.12H231.2g(或NaH2PO4H2O27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
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