麦胚蛋白双酶酶解物的制备及其体外醒酒活性的研究Word下载.docx
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TS201.4文献标识码:
A文章编号:
20170320
PreparationandinvitroSoberingActivityofWheatGermProteinHydrolysatesbyDoubleEnzymes
LuoSiyuan1GuoHongying1,2*ZhangLinna1WangFeng1,2TanXinghe1,2HeLei1
(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;
2.HunanProvincialKeyLaboratoryofFoodScienceandBiotechnology,Changsha410128,China)
AbstractForeffectiveutilizationofwheatgermandpreparewheatgermpeptideswithfacilitatingalcoholmetabolism,thedoubllyenzymatichydrolysisofwheatgermpretreatedbyNa2CO3wasstudied.Twoproteases,alcalaseandneutral,wereusedstepbystep.TheactivationrateofTCA-PSI,DHandADHofthewheatgermproteinshydrolysatesweremeasured.Theresultsshowedthatthesubstrateconcentrationofwheatgermproteinwas[S]3.5%,alcalasedosagewas[E]/[S]4000U/g,neutraldosagewas[E]/[S]1000U/g.Undertheseconditions,TCA-PSIwas75.49%,DHwas65.18%,andtheactivationrateofADHwas68.37%.Theseprovedthatthehydrolysatesofwheatgermproteinpossessofnoticeableactivityoffacilitatingalcoholmetabolism.
Keywordswheatgermprotein,doubleenzymehydrolysis,TCA-PSI,ADH,soberingactivity
小麦胚芽是小麦发芽及生长的器官之一,同时作为小麦生命的根源,是小麦中营养价值最高的部分[1],其又名麦芽粉、胚芽,呈金黄色颗粒状,约占整个麦粒的2%~3%。
麦胚含有丰富而优质的蛋白质、脂肪及多种维生素、矿物质等多种营养素,是优秀的人类营养素来源[2]。
小麦胚芽氨基酸组成合理,必需氨基酸的相互比值与FAO/WHO颁布的建议模式相似,其中赖氨酸——人类第一限制氨基酸的含量十分高[3]。
此外YiqiangGe等[4]和IrakozePierreClzver等[5]经过研究均发现麦胚蛋白具有很好的溶解性、乳化性、起泡性和持水性,不仅可作为畜肉制品的添加剂,以改善食品的结构和口感,还可强化食品营养。
近年来,国内外许多学者因麦胚蛋白的众多优点而产生了浓厚研究兴趣,并针对其酶解工艺及酶解产物的功能活性进行了广泛的研究。
张丽霞等[6]研究了碱性蛋白酶与胰蛋白酶双酶组合水解麦胚蛋白质的工艺及水解产物清除自由基的活性。
程云辉等[7]利用超滤法将抗氧化活性肽从麦胚蛋白酶解物中初步分离纯化,并比较了超滤前后麦胚蛋白酶解物的氨基酸组成、相对分子质量分布以及抗氧化活性,确定了最优工艺参数。
与此同时,国内有部分学者利用酶法或非酶法对麦胚蛋白饮料及氨基酸营养液进行研究与制备,以及以麦胚为原料研究开发了促进钙吸收、降胆固醇、降血压、抗氧化等生物活性肽,但尚未发现对麦胚多肽的醒酒活性进行研究。
酒精引起细胞损伤的因素是多方面的,其中乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase,ADH)活性降低是酒精引起细胞损伤的主要因素之一。
ADH是乙醇代谢过程中的关键酶,氧化型辅酶I(NAD+)作为乙醇代谢过程的氢受体与辅酶,是乙醇分解与代谢的必要酶,而多肽可以激活ADH活性并且提高血液中丙氨酸与亮氨酸浓度进而产生稳定的NAD+。
近年来,国内外学者对醒酒肽的研究也日益增多,如;
ZLMa等[8]利用高效液相色谱—质谱/质谱法鉴定了一种促进酒精代谢的玉米肽;
王真真等[9]对富硒玉米肽和普通玉米肽的醒酒活性进行了研究,并发现前者的功效优于后者;
XCPan等[10]评价了玉米低聚肽(COP)和姜黄素单独或联合应用对小鼠酒精性损伤的影响及醒酒作用;
刘晶晶等[11]以河蚬肉为原料,系统研究了醒酒肽的最佳酶解工艺;
宁庆鹏等[12]通过Alcalase蛋白酶制备了具有醒酒作用的花生粕醒酒肽;
LESeber等[13]进行了大豆醒酒肽的纯化及特性研究。
为高效利用麦胚资源,本文采用双蛋白酶酶解工艺,研究麦胚蛋白酶解物的体外醒酒活性,以期为麦胚等富含蛋白质的农副产品资源的深度开发和利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
小麦胚:
由中央储备粮株洲直属库提供,经干燥、脱脂、粉碎后备用。
无水碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠、甲醛、三氯乙酸、四氯化碳、硫酸铜、氢氧化钾、酒石酸钾钠等,均为分析纯,购自中国医药(集团)化学试剂有限公司;
碱性蛋白酶、中性蛋白酶:
购自丹麦诺维信公司。
1.2仪器设备
ZN-400A型高速中药粉碎机:
长沙市岳麓区中南制药机械厂;
80目标准筛:
浙江上虞市道墟筛具厂;
DK-98-IIA型恒温水浴锅:
天津市泰斯特仪器有限公司;
78-2型双向磁力搅拌器:
常州市华普达教学仪器有限公司;
pHS-3C型pH计:
上海精密科学仪器有限公司;
LXJ-IIB型低速大容量多管离心机:
上海安亭科学仪器厂;
WFJ7200型可见分光光度计:
尤尼柯(上海)仪器有限公司。
1.3试验方法
1.3.1酶解工艺流程
麦胚混合液添加Na2CO3调pH值碱性蛋白酶水解钝化蛋白酶
(95℃,10min)中性蛋白酶水解钝化蛋白酶(95℃,10min)调节pH至
肽得率
等电点离心麦胚蛋白酶解液水解度
ADH激活率
1.3.2麦胚的预处理及双酶酶解
称取一定量的麦胚粉(过80目筛),将预处理方式作为实验变量,共含五种形式:
热变性(80℃水浴加热30min)、微波处理(750W,30s)、添加5%Na2CO3溶液、剪切混合乳化处理(1500r/min,20min)以及未处理参照样品,保证其它反应条件相同,对这五种麦胚蛋白溶液进行Alcalase酶解,酶解条件为:
蛋白质浓度2.5%、温度为50℃、pH为9.0、Alcalase加酶量[E]/[S]为4000U/g、酶解时间为2.0h。
随后对五种麦胚蛋白酶解液进行水解度(DH%)测定,以筛选较佳的预处理方式。
将预处理后的麦胚蛋白酶解液水浴(40℃)振荡10min,调pH值至蛋白酶最适酸碱环境,按试验所需酶量加入蛋白酶并置于一定温度的恒温培养振荡器中进行酶解。
水解至设定时间后,将酶解液放入95℃的热水中水浴10min。
冷却至室温后,将其pH值调至4.0,然后离心(5000r/min)12min,将所得上清液pH调至7.0后即获得麦胚蛋白酶解液。
1.3.3肽得率的测定
采用双缩脲法测定水解液中酸溶性肽含量[14]。
(1)标准曲线的绘制。
以牛白蛋白作为标准蛋白质样,分别称取40、50、60、70、80、90、100、110mg于8支50mL纳氏比色管中,然后各加入1mL四氯化碳,再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL,振摇10min,静置1h,取上层清液离心5min,取离心分离后的透明液于比色皿中。
在560nm波长下测定各溶液的吸光度A,绘制牛血清白蛋白浓度X与吸光度Y之间的关系曲线:
Y=1.152*X-0.030,R²
=0.992。
(2)酸溶性肽含量的测定。
准确量取麦胚蛋白水解液10mL与10%TCA10mL,将二者混匀,静置20min后,在4000r/min条件下离心15min,用双缩脲测定上清液中的酸溶性肽含量。
每个样品做三个平行试验。
1.3.4肽得率(TCA-PSI)的计算
水解后产生的酸溶性肽用双缩脲法测定[15,16],原料中蛋白质含量用凯氏定氮法测定,肽得率(TCA-PSI/%)=酶解液中酸溶性肽含量/原料中蛋白质含量×
100%
1.3.5游离氨基氮含量的测定
采用甲醛电位滴定法[16]。
1.3.6水解度(DH)的计算
用甲醛电位滴定法测定水解液中游离氨基氮含量[17],用凯氏定氮法测定总氮含量,再按下式计算水解度:
水解度(DH%)=游离氨基氮含量/总氮含量×
1.3.7体外乙醇脱氢酶(ADH)激活率的测定
体外ADH激活率的测定采用用瓦勒一霍赫法进行[18]。
将1.5mL焦磷酸缓冲溶液(pH为8.8)、27mmol/L氧化型辅酶(NAD)1.0mL及11.5%的乙醇溶液0.5mL加入试管中,再加入样品溶液0.1mL,混匀后25℃水浴5min后,立即加入0.25u/mL乙醇脱氢酶(ADH)0.1mL,摇匀后于340nm处测定吸光度,每10s读数一次,连续测定5min。
激活率(%)=(加样组酶活力-空白组酶活力)/空白组酶活力
2实验结果与分析
2.1麦胚成分分析
对处理后待用的原料小麦胚进行成分分析,结果显示,蛋白质、脂肪、水分含量分别为28.73%,2.29%,14.54%,碳水化合物为50.16%,灰分为4.28%。
2.2预处理的影响
因为蛋白酶难以水解天然蛋白质分子中紧密的立体结构,所以对麦胚蛋白质进行预处理有一定意义,以破坏其高级结构,暴露出那些易与酶发生作用而又处于分子内部的部位,故而在一定程度上增加蛋白水解酶的作用位点,加快酶解速率[19-21]。
麦胚蛋白酶解液经五种方式预处理后的水解度(DH%)如图1所示。
图1预处理对碱性蛋白酶酶解的影响
从图1显示结果可得知,添加碳酸钠溶液和剪切乳化两种预处理方式对促进麦胚蛋白水解、提高
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