Transwell实验 超详细Word文档下载推荐.docx
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应用不合孔径和经过不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要考虑到细胞大小.这里主要谈几种大家经常使用的实验:
(1)共培养体系:
小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µ
m以下孔径.经常使用0.4、3.0µ
m.我们实验室用的是0.4µ
m.
将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B排泄或代谢产生的物质对细胞A的影响.
(2)趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µ
m膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化能力.
①细胞B对细胞A的趋化作用:
将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B排泄或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用.
②趋化因子对细胞的趋化作用:
将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用.
(3)肿瘤细胞迁移实验
经常使用8.0、12.0µ
m膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁移能力.
(4)肿瘤细胞侵袭实验
m膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似.
上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁移实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力.
用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种(引自司徒镇强《细胞培养》):
2.1体内癌细胞侵袭模型
2.1.1皮下移植侵袭模型
2.1.2肌肉内移植侵袭模型
2.1.3腹腔内移植侵袭模型
2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型
2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型
2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型
2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型
2.1.8视网内界膜侵袭模型
2.2体外癌细胞侵袭模型
2.2.1体外静止器官培养法
2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法
2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法
2.2.2半体外半体内器官培养法
2.2.3单层细胞器官培养法
2.2.4瘤细胞球体器官培养法
2.2.4.1静止球体器官培养法
2.2.4.2旋转摇动球体器官培养法
2.2.5单层细胞侵袭实验模型
2.2.6Transwell侵袭小室测定法
可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号,Transwell有多种应用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验.由于其复杂易行、重复性好,因而得到了越来越普遍的应用,但不克不及认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种办法.
第二节Transwell侵袭实验
我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验,其他方面的Transwell应用我不太清楚,因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验.
1.实验用品:
①Transwell小室:
多种厂家可提供,论坛里经常使用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.
这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是很是贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推荐给大家.BD也有已包被好的,价钱不清楚.Coster和Corning公司生产的小室,是论坛里比较经常使用的,仿佛是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有40左右,应该比较适合中国国情.
下面是一些战友提供的价钱,具体建议大家联系代理商咨询.linanping1979战友提供的价钱:
coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µ
m,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy战友提供的价钱:
Millipore的8µ
m的50个1760RMB,0.4µ
m的2000多,是一次性的.梅林战友提供的BD价钱:
240RMB一块(6.5um,24孔,12instert),仿佛是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy提供的价钱是:
corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到.平均每个20元不到.
Transwell小室依照公司的要求,都是一次性使用的.不过其实洗洗泡泡仍是可以重复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很洁净,用前用紫外里外都照30min.sword01战友提供的处理办法:
用棉签轻轻擦去胶和背面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×
5min,蒸馏水3×
5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,背面6h,微波,低火10min×
2.
因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验.以前的ChemiconECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以频频用良多次,但现在的膜已经改用一种很薄很脆的资料,一般只能重复用一次,真黑啊!
良多战友说Costar和Corning也是可以重复用的,大家可以试试.
自己没见过,有兴趣的可以自己研究一下.
另外,按照论坛战友提供的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用当时,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以试试.maojianwen战友的使用办法:
trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余的边沿.再照紫外.
②上层培养液:
上层培养液采取无血清培养基,为维持渗透压,需参加0.05%0.2%BSA.
③细胞:
值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP2的表达.如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不需要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数目,仍是小心为妙.
另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验.
④基质胶:
经常使用的是人工重构基底膜资料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的:
Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的东西在sigma叫ECM.zhangyong1036战友提供的价钱:
BD公司的matrigel1500左右.
如果采办的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要采办了.
⑤下层培养液:
下层经常使用含5%-10%FBS的培养基,具体浓度按照细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度.下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加下层培养液作为趋化因子,但团体认为,FBS仍是最适合的.
⑥细胞培养板:
经常使用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最经常使用.细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以.但要注意,细胞培养板应当与采办的Transwell小室相配套.
⑦此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin).良多战友认为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好.如果贴壁欠好的话可以试试看.linanping1979战友认为,如果培养时间很长(>
24h),细胞仍是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好仍是在膜下层涂上FN.
另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用.
2.步调
2.1Transwell小室制备
2.1.1无基质胶Transwell小室制备
①包被基底膜:
用50mg/LMatrigel1:
8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面.用胶原(collagen)的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.
②水化基底膜:
吸出培养板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min.
另有tianjin_glioma战友提供的办法:
在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel(3.9ug/ul)6080µ
l(注意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃30min使Matrigel聚分解凝胶.
2.1.2有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室参加300µ
l预温的无血清培养基,室温下静置15-30min,使基质胶再水化.再吸去剩余培养液.
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的
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