16SrDNA鉴定细菌的方法Word下载.docx
- 文档编号:15166358
- 上传时间:2022-10-28
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:242.52KB
16SrDNA鉴定细菌的方法Word下载.docx
《16SrDNA鉴定细菌的方法Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《16SrDNA鉴定细菌的方法Word下载.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
1.21MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)(1L):
121.1gTris,加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0.03个单位。
1.30.5MEDTA(pH8.0)(1L):
186.1gNa2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
1.410×
TEBuffer(pH7.4,7.6,8.0)(1L):
组分:
100mMTris-HCl,10mMEDTA。
1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5MEDTA(pH8.0)取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×
TEBuffer用10×
TEBuffer稀释10倍即可。
1.510%SDS(W/V):
称10g,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5MNaCl:
称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7MNaCl):
溶解4.1gNaCl,加10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。
8、氯仿/异戊醇:
按氯仿:
异戊醇=24:
1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1):
按苯酚与氯仿/异戊醇=1:
1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液:
使用液1×
:
0.04mol/LTris-乙酸,0.001mol/LEDTA。
浓储存液50×
242gTris,57.1ml冰醋酸,100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)。
11、6×
上样缓冲液(100ml):
0.25%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10mmol/LEDTA(pH8.0)(0.2ml),4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶:
称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50ml。
13、EB:
10mg/ml。
称取1g溴化乙锭定容至100ml。
棕色瓶室温避光保存。
EB的工作浓度为0.5ug/ml。
当配置50ml琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。
(因EB是剧毒物质,目前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)
14、蛋白酶K:
20mg/ml溶于水,-20℃保存,反应浓度50ug/ml,反应缓冲液:
0.01mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS,反应温度37-56℃。
无需预处理。
15、RNaseA:
25mgRNaseA加1MTris(pH7.5)25ul,2.5MNaCl15ul,无菌水2460ul,于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。
(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。
)
1.1细菌基因组DNA提取
基本步骤:
材料准备
破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸,并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器:
高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。
不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1快速微量提取法
Ø
取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min,丢去上清夜,收集菌体。
加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;
置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。
2蛋白酶/SDS法制备
✧用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.
✧4000rpm离心10min收集菌体,用WashingTE(50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0)洗菌体2次。
✧将菌体充分悬浮在5ml1×
TE缓冲液中,先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS,轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
✧用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次。
✧乙醇沉淀DNA。
✧用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适
当1×
TE或ddH2O中。
3
◆细菌培养:
细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。
◆细菌收集:
取1ml培养物于1.5mlEP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1mlTE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。
◆菌体裂解:
加入6μl50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS110μl,20mg/ml的蛋白酶K3μl,50℃作用3h或37℃过夜。
(此时菌液应为透明粘稠液体)。
◆抽提:
菌液均分到两个1.5mlEP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)。
◆沉淀:
加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。
12000rpm离心10。
◆洗涤:
沉淀用75%的乙醇洗涤。
◆抽(凉)干后,溶于50μlddH2O中,取2-5μl电泳。
作PCR模板用。
4.DNAEXTRACTIONPROCEDURE-GENERAL
✧Growcellsovernightin500mlbrothmedium.
✧Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH8.0),50mMEDTA.
✧Freezecellsuspensionat-20C
✧Add0.5ml250mMTris(pH8.0),10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature.Whenthawed,placeonicefor45min.
✧Add1ml0.5%SDS,50mMTris(pH7.5),0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.
✧Extractwith6mlTris-equilibratedphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transfertoplayertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessary.
✧Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).
SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.
✧Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.Transfertoplayertoanewtube.
✧SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA
✧CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricanalysis.
5CTAB/NaCl裂解法
⏹接两环菌(0.75ml甘油管菌液)于25mlLB培养基中,37℃、200r/min培养24h。
⏹取1.5ml菌液于1.5mlEppendorf离心管中,8000r/min离心5分钟,弃去上清。
⏹加入1.5mlTE离心洗涤后,用567ulTE溶解菌体,混匀。
⏹加入30μl10%SDS和3ul20mg/ml的蛋白酶K(100ug/ml),混匀,于37℃温育1h。
⏹加入100μl5mol/LNaCl,充分混匀,再加入80μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
⏹加入等体积的氯仿/异戊醇(24:
1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹加入0.6倍的异丙醇(0.48ml),轻轻混合直到DNA沉淀下来(0.5h),12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀,真空干燥0.5h。
⏹用50ul双蒸水溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。
⏹用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA,每孔点样6μl(4μl样品+2μlloadingbuffer),80V,电泳1.5小时。
2.设计选择引物进行16SrDNA的PCR扩增
一般细菌鉴定选择通用引物,最常用的通用引物为27F/1492R。
27F:
5'
-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R:
-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.1实验原理
2.1.1PCR
多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称PCR技术,是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。
此法操作简便,可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝,PCR技术虽然问世仅数年时间,但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域,引起了生物技术发展的一次革命,目前它在分子克隆,目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 16 SrDNA 鉴定 细菌 方法