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鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸,故在缺乏组氨酸的培养基上,仅少数自发回复突变的细菌生长;
大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸,故在缺乏色氨酸的培养基上,仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在,则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型,因而能生长形成菌落,据此判断受试物是否为致突变物.
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变,故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9 混合液。
4ﻩ仪器和设备
培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机,玻璃器皿等。
5 培养基和试剂
5。
10.5组氨酸-0。
5色氨酸-0.5 生物素溶液
成分:
组氨酸(155)
78
生物素(244)
122
色氨酸(204)
102
加蒸馏水至
1000
配制:
将上述成分加热,以溶解生物素,然后在0.068下高压灭菌20。
贮于 4℃冰箱。
若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸。
5.2ﻩ顶层琼脂培养基
成分:
琼脂粉ﻩ1。
2g
氯化钠ﻩ1.0g
加蒸馏水至ﻩ200
配制:
上述成分混合后,于0。
103 下高压灭菌 30。
实验时,加入 0.5组氨酸—0.5色氨酸-0.5生物素溶液 20。
5.3ﻩ() 培养基E
枸椽酸(C6H8O7·
H2O)ﻩ100g
磷酸氢二钾(K24)ﻩ500g
磷酸氢铵钠(44·
4H2O)175g
硫酸镁(4·
7H2O)10g
加蒸馏水至ﻩ1000
先将前三种成分加热溶解后,再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中,加蒸馏水至1000。
于0。
103下高压灭菌30.储于4℃冰箱.
5.4ﻩ20%葡萄糖溶液
葡萄糖200g
加蒸馏水至ﻩ1000
加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖,再加蒸馏水至1000.于0。
068下高压灭菌20。
储于4℃冰箱.
5ﻩ底层琼脂培养基
琼脂粉7.5g
蒸馏水ﻩ480
培养基Eﻩ10
20%葡萄糖溶液ﻩ10
首先将前两种成分于0。
103下高压灭菌 30后,再加入后两种成分,充分混匀倒底层平板。
按每皿25制备平板,冷凝固化后倒置于 37℃培养箱中24h,备用。
5。
6ﻩ营养肉汤培养基
牛肉膏ﻩ2.5g
胰胨ﻩ5.0g
磷酸氢二钾(K24)1.0g
加蒸馏水至500
将上述成分混合后,于0。
103下高压灭菌30。
储于 4℃冰箱。
7ﻩ盐溶液(1.650。
4 2)
氯化钾()ﻩ61。
5g
氯化镁(2·
6H2O)ﻩ40。
7g
加蒸馏水至500
在水中溶解上述成分后,于0.103 下高压灭菌30.储于 4℃冰箱.
5.8ﻩ0。
2磷酸盐缓冲液(7。
4)
磷酸二氢钠(24·
2H2O)ﻩ2.965g
磷酸氢二钠(24·
12H2O)29.015g
加蒸馏水至500
溶解上述成分后,于0.103下高压灭菌 30。
储于4℃冰箱。
5.9ﻩS9混合液
成分ﻩ每毫升 S9 混合液
肝 S9ﻩ100μl
盐溶液ﻩ20μl
灭菌蒸馏水ﻩ380μl
0.2磷酸盐缓冲液ﻩ500μl
辅酶()ﻩ4μ
6-磷酸葡萄糖(6)ﻩ5μ
将辅酶和 6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重,然后按上述相反的次序加入各种成分, 使肝S9加到已有缓冲液的溶液中.该混合液必须临用现配,并保存于冰水浴中。
实验结束,剩余 S9 混合液应该丢弃。
5.10菌株鉴定用和特殊用途试剂
5.10.1组氨酸-色氨酸-生物素平板
琼脂粉ﻩ15g
蒸馏水 934
()培养基 Eﻩ 20
20%葡萄糖ﻩ 20
灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5100) ﻩ 10
灭菌盐酸色氨酸水溶液(0。
5100) 10
灭菌0.5生物素溶液ﻩ6
高压灭菌琼脂和水后,将灭菌20%葡萄糖, 培养基、组氨酸溶液,加进热的琼脂溶液中(若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸,同时蒸馏水改为944)。
待溶液稍微冷却后,加入灭菌生物素,混匀,浇制平板。
10.2氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板
琼脂粉15g
蒸馏水 930
()盐溶液ﻩ20
20%葡萄糖ﻩ20
灭菌盐酸组氨酸溶液(0.5100)ﻩ10
灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5100) 10
灭菌0.5生物素溶液6
氨苄青霉素溶液(8 于0.02中)ﻩ3。
15
四环素溶液(8 于0。
02 中)ﻩ0。
25
琼脂和水高压灭菌 20,将无菌的葡萄糖、盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液,加进热的琼脂溶液中,混匀(若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸,同时蒸馏水改为加940)。
冷却至大约50℃,无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液.
应该在倾注琼脂平板后几天内,制备主平板.
5.10.3ﻩ营养琼脂平板
琼脂粉7.5g
营养肉汤培养基ﻩ500
于0.103下高压灭菌30后倾注平板.
6试验菌株及其生物学特性鉴定
6.1ﻩ试验菌株
采用以下菌株作为标准组合:
鼠伤寒沙门氏菌1535;
鼠伤寒沙门氏菌97或97a或1537;
鼠伤寒沙门氏菌98;
鼠伤寒沙门氏菌100;
鼠伤寒沙门氏菌102或大肠杆菌2或大肠杆菌2(101);
6。
2ﻩ生物学特性鉴定
新获得的或长期保存的菌种,在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。
菌株鉴定的判断标准,如表1所示。
表1ﻩ试验菌株鉴定的判断标准
菌株
组氨酸缺陷
色氨酸缺陷
脂多糖屏障缺损
氨苄青霉素抗性
切除修复缺损
四环素
抗性
自发回变菌落参考数*
实验室
97
+
/
—
90~180*
75~200*
97a
+
90~180*
75~200*
98
30~50
20~50
100
100~200
75~200
102
-
240~320*
100~400*
1535
10~35
5~20
1537
3~15
5~20
2
/
-
5~20
2(101)
100~200
注
“+"
表示需要组氨酸
“+”表示需 要色氨酸
“+”表示具 有突变
“+”表示具 有R因子
表示对于鼠伤寒沙门氏菌具有△
突变,对于大肠杆菌,具有△突变
表示具有1 质粒
*在体外代谢活化条件下自发回变菌
落数略增。
对于各菌的自发回变范围,各个实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库,形成适合本实验室条件的适用范围。
同时,实验室背景数据应当与文献报道相符。
6.2。
1ﻩ组氨酸缺陷/色氨酸缺陷
原理:
组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸,只能在补充组氨酸的培养基上生长,而在缺乏组氨酸的培养基上,则不能生长。
色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸,只能在补充色氨酸的培养基上生长,而在缺乏色氨酸的培养基上,则不能生长。
鉴定方法:
将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线,于37℃下培养 24h后观察结果。
结果判断:
组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长,而在无组氨酸平板上则不能生长;
色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生长,而在无色氨酸平板上则不能生长。
6.2。
2ﻩ脂多糖屏障缺损
具有深粗糙()的菌株,其表面一层脂多糖屏障缺损,因此一些大分子物质,如结晶紫能穿透菌膜进入菌体,从而抑制其生长,而野生型菌株则不受其影响。
吸取待测菌株增菌液0.1于营养琼脂平板上划线,然后将浸湿的 0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。
37℃下培养 24h后观察结果。
结果判断:
假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带,说明该待测菌株具有突变。
2.3氨苄青霉素抗性
含 R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。
因为 R 因子不太稳定,容易丢失,故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
吸取待测菌株增菌液 0.1,在氨苄青霉素平板上划线,37℃下培养24h后观察结果.
结果判断;
假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长,说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用,表示含R 因子,否则,表示测试菌不含R 因子或R因子丢失.
6.2.4ﻩ紫外线敏感性
原理:
具有△突变的菌株对紫外线敏感,当受到紫外线照射后,不能生长,而具有野生型切除修复酶的菌株,则能照常生长.
吸取待测菌株增菌液0。
1于营养琼脂平板上划线,用黑纸盖住平板的一半,置紫外灯下照射(15W,距离33)8秒钟。
置37℃下孵育 24h后观察结果。
具有△突变的菌株对紫外线敏感,经辐射后细菌不生长,而具有完整的切除修复系统的菌株,则照常生长。
6。
2。
5ﻩ四环素抗性
具有 的菌株对四环素有抗性。
吸取待测菌株增菌液0.1于氨苄青霉素/四环素平板上划线,置37℃下孵育24h后观察结果。
假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长,表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性,具有质粒,否则,说明测试菌株不含 质粒。
6。
2.6ﻩ自发回变
每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变,称为自发回变。
这种自发回变是每种试验菌株的一项特性.
鉴定方法:
将待测菌株增菌液0。
1加到2含组氨酸-色氨酸-生物素的顶层琼脂培养基的试管内(若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸),混匀后铺到于底层琼脂平板上,待琼脂固化后,置3
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