整理03第3章氨基酸和蛋白质Word格式文档下载.docx
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常见的蛋白质氨基酸(基本氨基酸)有20种,是构成蛋白质的结构单元。
20种基本氨基酸中,有19种氨基酸是α-氨基酸,即与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基。
脯氨酸是亚氨基酸。
各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同,根据R基团结构的不同,可以将20种氨基酸分为脂肪族、芳香族和杂环族3类。
按照R基团的极性性质,又可以将20种氨基酸分为4类:
非极性R基氨基酸,不带电荷的极性R基氨基酸,带正电荷的R基氨基酸,带负电荷的R基氨基酸。
氨基酸侧链R基的性质决定了蛋白质的结构特点、性质和功能。
不常见的蛋白质氨基酸有10多种,在蛋白质中由基本氨基酸经过修饰生成的。
3.氨基酸的两性性质
在结晶状态或在水溶液中,氨基酸主要以两性离子形式存在。
α-羧基pK1在2.0左右,当pH>
3.5,α-羧基主要以-COO-形式存在。
α-氨基pK2在9.4左右,当pH<
8.0时,α-氨基主要以α-NH+3形式存在。
氨基酸在pH3.5-8.0时,带有相反电荷,是两性离子。
在溶液中,氨基酸带有的电荷性质和电荷量随溶液pH值变化而变化。
甘氨酸溶点232℃,比相应的乙酸(16.5℃)和乙胺(-80.5℃)都高,可推测氨基酸在晶体状态是以两性离子形式存在的。
溶液中的氨基酸所带的净电荷为零时,此时溶液的pH值称氨基酸的等电点,用pI表示。
氨基酸等电点的计算:
中性氨基酸pI=(pKa-COOH+pKa-NH3)/2,酸性氨基酸pI=(pKa-COOH+pKR)/2,碱性氨基酸pI=(pKa-NH3+pKR)/2。
4.氨基酸侧链R基的特性
(1)侧链R为脂肪烃基的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)R基是中性烷基(Gly是H),对整个氨基酸分子的酸碱性影响很小。
这5种氨基酸几乎有相同的等电点(6.0±
0.03)。
从甘氨酸到异亮氨酸,侧链R基团的疏水性逐渐增加。
(2)侧链R中含有羟基的氨基酸(Ser、Thr)丝氨酸中的-OH基(pKa=15),在生理条件下不解离,是一个极性基团,能与其它基团(羟基和氨基等)形成氢键,具有重要的生理意义。
在许多酶的活性中心都有丝氨酸残基存在。
苏氨酸中的基羟基是一个仲醇,具有亲水性,但此羟基形成氢键的能力较弱。
苏氨酸在蛋白质活性中心中很少出现。
(3)侧链R中含硫的氨基酸(Cys、Met)半胱氨酸的R侧链中含巯基,两个半胱氨酸的巯基氧化生成二硫键,利于稳定蛋白质的空间结构。
甲硫氨酸中含有甲硫基(-SCH3),在生物体内是一种重要的甲基供体。
(4)侧链R中含有酸性基团的氨基酸(Asp、Glu)半胱氨酸侧链羧基pKa(β-COOH)为3.86,谷氨酸侧链羧基pKa(γ-COOH)为4.25,它们在生理条件下带有负电荷。
(5)侧链R中含有酰胺基团的氨基酸(Asn、Gln)天冬酰胺和谷氨酰胺易发生氨基转移反应,转氨基反应在生物合成和代谢过程中有重要意义。
(6)侧链R中含碱性基团的氨基酸(Lys、Arg)赖氨酸的R侧链上含有一个氨基,侧链氨基的pKa为10.53。
生理条件下,赖氨酸侧链带有一个正电荷(-NH3+)。
此外,赖氨酸的侧链有4个C的直链,柔性较大,使侧链氨基的反应活性增大。
例如,肽聚糖短肽间的连接。
精氨酸是碱性最强的氨基酸,侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱,pKa值为12.48,生理条件下完全质子化。
(7)侧链R中含有芳香基团的氨基酸(Phe、Try)苯丙氨酸和酪氨酸都具有共轭π电子体系,容易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物(charge-transfercomplex)或电子重叠复合物。
在生物大分子的相互识别过程中具有重要作用。
这2种氨基酸在紫外区有特征吸收峰,蛋白质的紫外吸收部分来自这2种氨基酸。
(8)侧链R为杂环的氨基酸(Trp、His、Pro)色氨酸有复杂的π电子共轭休系,它比苯丙氨酸和酪氨酸更易形成电荷转移络合物。
色氨酸的π共轭休系最大,在280nm处,色氨酸吸收最强,酪氨酸次之,苯丙氨酸最弱。
组氨酸含咪唑环,咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同,前者pKa为6.00,后者为7.35,它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种。
在接近中性pH时,可离解平衡,具有缓冲能力。
脯氨酸是环状结构的氨基酸,它的α-亚氨基是环的一部分,因此具有特殊的刚性结构。
在多肽链中,脯氨酸残基所在的位置往往发生骨架方向的变化,它在形成球状蛋白质空间的结构中具有重要作用。
5.氨基酸的两性性质
6.氨基酸的化学反应
DNS-CL(丹磺酰氯)反应:
在弱碱性溶液中,氨基酸的氨基可以与丹磺酰氯(5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯)发生酰基化反应,生成DNS-氨基酸。
此反应可以标记多肽链N末端氨基酸,用于测定多肽和蛋白质的N末端氨基酸。
Sanger反应:
在弱碱性溶液中,氨基酸的氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB或FDNB)发生亲核芳香取代反应,生成二硝基苯基氨基酸。
此反应可以用来分析多肽的N末端氨基酸。
Edman反应:
在弱碱性条件下,α-氨基酸与苯异硫氰酸酯(PITC)反应,生成苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-氨基酸)。
PTC-氨基酸可以环化,生成苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-氨基酸),用层析法可以分离鉴定PTH-氨基酸。
用此方法可以分析多肽链N末端的氨基酸序列。
茚三酮反应:
在弱酸性条件下,α-氨基酸与茚三酮共热,发生氨基氧化脱氨和脱羧反应,生成紫色化合物,最大吸收波长λmax是570nm。
脯氨酸与茚三酮反应,生成亮黄色化合物,最大吸收波长λmax是440nm。
此反应可以用于氨基酸含量的分析。
氨基与酰化试剂反应酰化试剂有苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯,以及5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯(丹磺酰氯DNS-Cl)。
氨基与烷基化试剂反应α-羧基中的氮是一个亲核中心,能发生亲核取代反应。
生成西佛碱的反应(Schiff)氨基酸的α-氨基与醛类反应,生成西佛碱,西佛碱是很多酶促反应中的中间产物,例如转氨基反应的中间产物。
含硫氨基酸的烷基化反应硫原子也是亲核中心,可发生亲核取代反应。
生物体内,重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸(SAM),是由Met与ATP作用得到的S-烷基化产物。
在酶催化下,SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化,如磷脂酰胆碱的生物合成。
α-羧基参加的反应羧基与碱反应生成盐,与醇反应生成酯。
羧基与二氯亚砜或五氯化磷反应生成酰氯,使羧基活化,可以用于多肽的人工合成。
7.氨基酸的光学性质
氨基酸的α碳是一个不对称碳(甘氨除外)原子,氨基酸有D型和L型两种构型。
蛋白质中的氨基酸都是L型,有些抗生素或微生物的细胞壁中有D型氨基酸。
外消旋作用:
混合等摩尔的D型和L型氨基酸,可以得到无旋光性的DL-消旋物。
内消旋作用:
一个D型半胱氨酸和一个L型半胱氨酸,氧化生成内消旋胱氨酸。
色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收紫外光。
蛋白质分子在280nm有最大紫外光吸收,是因为蛋白质分子中含有这3种氨基酸残基。
8.氨基酸的分离和分析
用纸层析、薄层层析、电泳、阳离子交换层析等方法可以分离氨基酸混合物。
阳离子交换层析法:
用含Na+的缓冲液将阳离子交换树脂处理成钠盐,且pH值在2左右。
将游离氨基酸的混合溶液(pH2-3)加入柱中,此时氨基酸都以阳离子形式存在,与树脂上的钠离子交换,被固定在树脂上。
逐步提高洗脱液的pH值,减小氨基酸带有的正电荷量;
同时逐步提高洗脱液的盐浓度,减小氨基酸与树脂的作用力,可以将固定在树脂上的氨基酸以不同的速度洗脱下来。
被分离的氨基酸与茚三酮发生显色反应,根据衍生物对光吸收的强弱,可以定量分析各种氨基酸。
氨基酸与离子交换树脂的作用力主要有:
静电吸引力和氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力。
静电吸引力的大小直接与氨基酸的等电点有关,静电吸引力的大小顺序是:
碱性氨基酸﹥中性氨基酸﹥酸性氨基酸。
在等电点比较接近的氨基酸中,R侧链残基的疏水性越高,与树脂基质作用力越大,在层析柱中的停留时间(保留时间)越长。
(二)肽
1.肽和肽键的结构
肽是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物,氨基酸间脱水后生成的共价键称肽键(酰氨键),其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
由两个氨基酸缩合而成的肽称为2肽,少于10个氨基酸残基的肽称为寡肽,多于10个氨基酸残基的肽称为多肽。
肽链上的各个侧链由不同的氨基酸R侧链构成。
肽键的结构特点:
酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用,稳定性高。
肽键亚氨基在pH0-14内不解离,6个原子几乎处在同一平面内。
2.肽的化学性质
肽的α-羧基、α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
含有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应,可用于定量分析。
肽与双缩脲反应生成紫色或蓝紫色化合物,这是肽和蛋白质特有的反应,游离氨基酸无此反应。
3.生物活性肽
生物体内有很多具有生物活性的多肽和寡肽,称活性肽。
活性肽在生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等过程中起重要作用。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息传递的主要化学信使,很多激素、抗生素都属于肽类或肽衍生物。
(三)蛋白质一级结构
1.蛋白质的结构层次
一级结构:
蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)。
二级结构:
多肽链中各个肽段借助氢键形成有规则的构象。
主要有α-螺旋、β-折叠和β-转角。
超二级结构:
由两个或两个以上二级结构单元相互聚集,形成的有规则的二级结构的组合体。
例如αα、βαβ、βββ等结构。
结构域:
多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠区。
结构域是蛋白质的独立折叠单位,一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构:
多肽链借助各种非共价键的作用力,通过弯曲、折叠,形成具有一定走向的紧密球状构象。
球状构象的比表面积最低,使蛋白质与周围环境的相互作用力最小。
四级结构:
寡聚蛋白中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。
2.蛋白质一级结构测定
蛋白质测序的基本策略:
用两种以上不同的裂解方法裂解蛋白质,产生两套切点不同的肽段。
分离、纯化每一个肽段,分别测定每一个肽段的氨基酸序列,用重叠法拼接出一条完整的肽链。
主要步骤:
A.根据蛋白质末端分析结果和相对分子质量,确定蛋白质分子中多肽链的数目。
B.如果蛋白质是寡聚蛋白,用变性剂(如8.0mol/L尿素)拆分蛋白质亚基。
C.断开多肽链内的二硫键。
D.分析每一条多肽链的氨基酸组成,计算多肽链中氨基酸残基的数目。
E.分析N-末端和C-末端氨基酸,确定氨基酸测序的两个端点。
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- 整理 03 氨基酸 蛋白质
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