猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Word文档下载推荐.docx
- 文档编号:15100803
- 上传时间:2022-10-27
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:79.24KB
猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Word文档下载推荐.docx
《猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Word文档下载推荐.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Word文档下载推荐.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
本标准规定了猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的诊断方法。
本标准适用于猪断奶后多系统衰竭综合征的诊断。
2诊断方法的种类和选用
确诊PMWS需要三个条件:
存在相应的临床症状,特征性病理变化,从病灶中检出PCV2病原。
根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断,确诊必须依靠实验室检查。
目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(IELISA)、免疫组织化学试验(IHC)等。
病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。
PCR方法用于检测PCV病毒的核酸,应用型特异性引物可对PCV1和PCV2定型。
IFA、间接ELISA方法主要用于检测PCV病毒抗体。
IHC方法主要用于检测PCV病毒抗原,并进行病毒的组织学定位。
本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国生猪PMWS的诊断方法,保证了我国对PMWS的诊断与国外的一
致性。
在实际应用时,可根据需要和条件,从中选用1-2种方法即可。
3临床症状和病理变化
3.1临床症状
根据以下主要的临床症状可作出初步临床诊断:
最常见的、也是确诊PMWS所必需的临床症状是衰竭和生长发育不良,进行性消瘦;
其它症状如精神不振、食欲不佳、被毛粗乱,消化不良、肌肉衰弱无力、腹泻、皮肤苍白、黄疸,还有咳嗽、喷嚏、呼吸困难等呼吸系统症状。
体表淋巴结,特别是腹股沟淋巴结肿大。
其它不常见的症状有发热、嗜睡、胃溃疡、中枢神经紊乱、猝死。
这些临床症状不会同时在同一头猪上出现。
发病猪场在一段时间内会出现大多数症状。
一些临床症状由于继发感染或双重感染而恶化。
3.2病理变化
3.2.1剖检变化
最显著的病变是全身淋巴结,特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大到2-5倍,有时可达10倍。
在PMWS感染猪也观察到正常或萎缩的淋巴结。
切面硬度增大,均匀的苍白色,集合淋巴小结也肿大。
发生细菌感染,则淋巴结可见炎症和化脓病变,使病变复杂化。
———————————
作者简介:
崔尚金:
博士,副研究员,目前主要从事动物疫病诊断、流行病学、地理信息系统GIS和外来病的研究工作.
*通讯作者,E-mail:
cuisj2000@.hk;
其它组织有广泛的淋巴细胞、单核细胞、组织细胞浸润。
4病毒的分离与鉴定
4.1材料准备
4.1.1器材:
25cm2(T25)细胞培养瓶、直径15mm盖玻片、55mm圆形有盖平皿、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(CO2)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。
4.1.2试剂:
RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素(105ug/mL)与链毒素(105ug/mL)溶液、氯仿、300mMD(+)氨基葡萄糖、Hanks平衡盐溶液。
4.1.3细胞培养物:
无PCV污染的猪肾传代细胞PK-15。
4.1.4样品
4.1.4.1样品的采取和送检:
在发病早期,无菌采取病猪的血清。
对病死猪立即采取肺、扁桃体、淋巴结、脾、肾、肝等组织数小块,置冰瓶内立即送检。
不能立即检查者,应放-25℃~-30℃冰箱中,或加50%甘油生理盐水,4℃保存送检。
4.1.4.2样品的处理:
若样品经PCR检测为PCV阳性,按如下方法进行处理。
血清可直接使用。
肺、淋巴结、扁桃体、脾、肾、肝等组织混合,组织剪碎后研磨成糊状,加入含有105ug/ml链霉素,105ug/ml青霉素,两性霉素B200ug/ml的RPMI1640营养液,制成10%(W/V)悬液,-20℃反复冻融3次或-70℃冻融1次,2000g离心30min。
吸取上清液,转移到新的离心管中,每1ml上清加入50ul氯仿,室温下不断混合10min,1000g离心10min。
怀疑有细菌污染的样品,也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。
取上清,注意避免吸出氯仿,分装,-70℃保存。
4.2操作方法
4.2.1接种样品:
取2ml上清液加到18mlPK-15细胞悬液,细胞浓度达到5×
104个/ml,培养液用10%犊牛血清和1%双抗的RPMI1640。
将12ml病毒细胞混合悬液分装到2个25cm2(T25)通气的细胞培养瓶中,每瓶6ml。
6ml加入到装有直径15mm盖玻片的55mm圆形有盖平皿中,置于37℃5%CO2培养箱。
4.2.2细胞处理:
接种后18-24h长成50-60%单层细胞,倾去培养瓶中培养液,加入2-3ml预热300mMD(+)氨基葡萄糖,能覆盖细胞足以,放入37℃培养箱继续作用30min。
去除氨基葡萄糖,以Hanks平衡盐溶液冲洗2-3次,加入含有2%血清的维持液,放回培养箱。
4.2.3继续培养48h后,用间接免疫荧光法对平皿中的玻片培养物进行染色,以监控病毒生长。
4.2.4重复感染:
取1个T25瓶反复冻融3次。
用胰酶消化另一个T25瓶内细胞,悬于21ml生长液,再加入第一瓶中的细胞悬液6ml,取15ml接到一个75cm2(T75)瓶,6ml接到一个T25瓶,6ml接种到有盖玻片的平皿中。
4.2.572-96h后取平皿中玻片进行免疫荧光染色,观察病毒的生长情况。
将T25瓶反复冻融3次,接种到T75瓶内,继续传代。
取少量细胞悬液进行PCR的检测。
4.3结果的判断和解释
在第一代培养时,若IFA检测为阴性应继续盲传,第三代培养IFA、PCR检测为阳性,则判定为PCV病毒分离阳性。
5聚合酶链式反应(PCR)
5.1材料准备
5.1.1器材:
微量移液器、吸头、离心机、研磨器、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温干燥箱等。
5.1.2试剂:
Tris饱和酚、氯仿、10%SDS、50ug/ml蛋白酶K、无水乙醇或异丙醇、3MpH5.2醋酸钠、75%乙醇;
TaqDNA聚合酶、dNTP(2.5mmol/l)、10×
Buffer、灭菌去离子水、特异性引物、标准DNA分子量的Marker、上样缓冲液。
5.2病毒DNA的提取:
5.2.1样品的处理:
取发病猪脾、淋巴结、肝、肾等脏器剪碎加入适量生理盐水研磨制成组织匀浆,反复冻融3次,3000g离心20min,吸取上清用于提取DNA。
发病猪的全血和血清可直接进行检测。
5.2.2核酸提取:
5.2.2.1取500ul组织冻融上清、全血或血清加入25ul10%SDS,5ul蛋白酶K,振荡混合数次,置37-56℃水浴锅中2-3小时,其间振荡混合几次。
5.2.2.2酚抽提:
每管中加入200ul酚,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
吸出上层水相,转移到新管。
5.2.2.3酚/氯仿抽提:
每管分别加入100ul和100ul氯仿,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
吸出上层水相,转移到新管,并作好标记。
5.2.2.4氯仿抽提:
每管分别加入200ul氯仿,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
5.2.2.5每管中加入2.5倍无水乙醇,1/10体积的3MpH5.2NaAc(醋酸钠),混合数次,-20℃沉淀2h或过夜。
或每管中加入等体积的异丙醇,1/10体积的3MpH5.2NaAc(醋酸钠),混合数次,室温下沉淀20-30min。
5.2.2.613000rpm离心10-15min,倒掉管内液体,在滤纸上吸干,不要求完全干燥。
5.2.2.7每管中加入100-200ul70%的乙醇,12000rpm离心5min。
倒掉管内液体,在滤纸上吸干,放入37℃温箱烘干。
5.2.2.820-40ul灭菌水溶解沉淀,反复吹打沉淀,促进沉淀溶解。
5.2.3PCR扩增:
PCR反应液应在冰上配制,配液顺序:
灭菌水,10×
buffer,dNTP,引物,Taq酶,样品DNA。
5.2.3.150ul的反应体系:
Taq(5U/ul):
0.4-0.5ul
10×
buffer:
5ul
dNTP(2.5mM):
4ul
引物1(10pmol/ul):
2ul
引物2(10pmol/ul):
灭菌水:
upto50ul
模板DNA:
5.2.3.2PCV病毒特异性引物序列:
能扩增PCV1和PCV2,扩增片段938bp。
P1:
5'
-gTCTTCTTCTgCggTAACgCCTCCTTg-3'
,P2:
-TAggAggCTTCTACAgCTgggACAg-3'
;
PCV2型特异性引物序列:
扩增片段为490bp。
P3:
-ATTgTAgTCCTggTCgTATATACTgT-3'
,P4:
-CTCCCgCACCTTCggA-3'
5.2.3.3PCR的反应条件:
95℃5min;
94℃1min,52℃1min,72℃1min,35个循环;
72℃10min.
5.2.3.4PCR电泳:
取5ulPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。
5.2.4结果判定与解释:
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,扩增出938bp和490bp的两条带为PCV2阳性。
只扩增出938bp一条带为PCV1阳性。
同时应设正常PK-15细胞DNA、水阴性对照,不能扩增出任何条带。
PCV1阳性DNA的阳性对照可扩增938bp,PCV2阳性DNA的阳性对照可扩增938bp和490bp的两条带。
6间接免疫荧光试验(IFA)
6.1材料准备
6.1.1器材:
荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。
6.1.2试剂
6.1.2.1IFA诊断板的制备:
见附录。
6.1.2.2兔抗猪异硫氰酸荧光黄(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
6.1.3样品:
采集被检猪血液,分离血清,血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。
试验前将被检血清统一编号,并用PBS液作20倍稀释。
6.2操作方法
6.2.1取IFA诊断板,编号,弃去板中的乙醇溶液,置超净工作台中风干,每孔加100μLPBS液洗一次,弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 圆环 病毒 引起 断奶 系统 衰竭 综合征 诊断 方法 标准 建立