保健食品用乳酸菌评价文档格式.docx
- 文档编号:15086394
- 上传时间:2022-10-27
- 格式:DOCX
- 页数:27
- 大小:42.90KB
保健食品用乳酸菌评价文档格式.docx
《保健食品用乳酸菌评价文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《保健食品用乳酸菌评价文档格式.docx(27页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备
GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验
GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏检验
GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
GB7718预包装食品标签通则
SN/T0738出口食品中肠杆菌科检验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1乳酸菌(LAB)Lacticacidbacterium(LAB)
能使糖发酵、并产生大量乳酸的细菌的通称,不能液化明胶、也不产生吲哚、呈格兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性反应、硝酸还原酶阴性反应和细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。
注:
本标准中所涉及的乳酸菌是食品加工业重要的食品原料,主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和片球菌属(Pediococcus)等。
4分类
4.1按菌种类型和菌株数分为:
——单菌株乳酸菌:
只含有一种明确菌株的乳酸菌产品;
——单菌种多菌株乳酸菌:
含有一株以上属于同一种的乳酸菌产品;
——多菌种乳酸菌:
含有一个种以上的乳酸菌产品。
4.2按使用温度分为:
——嗜温乳酸菌:
使用温度在18℃~37℃的乳酸菌产品;
——嗜热乳酸菌:
使用温度在30℃~45℃的乳酸菌产品。
4.3按物理形态分为:
——液体:
以液体形式存在的乳酸菌产品;
——冷冻:
以深度冷冻形式存在的乳酸菌产品;
——干燥:
经冷冻或低温喷雾等方式以干燥形式存在的乳酸菌产品。
5要求
5.1乳酸菌种
菌种除符合国家或行业相关规定外,还应符合表1规定。
表1菌种要求
项目
菌种要求
属、种、株的鉴定
鉴定到株
表型实验
基因分型实验
安全性实验
5.2感官
感官应符合表2规定。
表2感官要求
要求
液体
冷冻
干燥
色泽
白色至棕色
气味
具有乳酸菌特殊气味,无腐败,无异臭
组织状态
混悬液,可有沉淀
不规则冻状固体
粉末或颗粒
杂质
无肉眼可见异物
5.3理化
理化要求应符合表3的规定。
表3理化要求
保健食品用
产酸能力/(h或△pH)
符合产品标称
发酵酸度(以乳酸计)/%
产过氧化氢能力
产细菌素能力
抗氧化能力
对胃酸和胆盐的耐受性
粘膜的黏附性或人上皮细胞的黏附性
对条件致病菌的抗菌活性
5.4微生物
5.4.1乳酸菌微生物应符合表4的规定。
表4乳酸菌微生物要求
乳酸菌活菌数/(CFU/g或CFU/mL)
108
乳酸菌活菌数是保质期内应达到的活菌数。
5.4.2其他微生物应符合表5的规定。
表5其他微生物要求
酵母和霉菌/(CFU/g)<
1
10
肠杆菌科/(CFU/g)<
金黄色葡萄球菌/g
不应检出
沙门氏菌/g
单核细胞增生李斯特氏菌/g
是不是不用分液体、冷冻和干燥,直接是菌粉
5.5保健功能要求应符合表6的规定。
表6保健功能要求
调节肠道菌群a
具有
提高免疫力b
具有a或b中一项保健功能即可。
6试验方法
本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T6682-2008规定的三级水。
试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。
6.1菌种鉴定
6.1.116SrDNA序列同源性的鉴定方法
6.1.1.1原理
核糖体RNA(rRNA)等保守性生物大分子广泛存在于生物细胞中,功能稳定,核酸序列中既有高度保守区又有可变区,因此可利用这些序列的信息对细菌进行鉴定和分类学研究。
16SrDNA是16SrRNA的基因,长约1.5kb。
利用细菌域的通用引物扩增16SrRNA基因,序列测序后,输入GenBank中进行同源性分析,判定某个分类单位在系统发育树上的分类级别。
6.1.1.2试剂和溶液
1TE溶液:
10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。
2STE溶液:
0.1mol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。
3溶菌酶储液:
用水配制成50mg/mL的溶菌酶储液,分装成小份并保存于-20度。
420%十二烷基硫酸钠(SDS):
在800mL水中溶解200g电泳级SDS,加热至68度助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至1L,分装备用。
55moL/L高氯酸钠。
6氯仿:
异戊醇(24:
1)。
7无水乙醇。
83mol/L的乙酸钠(pH5.2):
在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容到1L,分装后高压灭菌。
91×
Tris-乙酸(TAE)电泳缓冲液:
40mmol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA,pH8.0。
10LB液体或固体培养基。
6.1.1.3分析步骤
1菌体收集培养
将待鉴定菌在1~5mL适宜的培养基和生长温度下培养至对数生长后期,12000r/min离心5min,收集菌体。
2DNA提取用细菌基因组DNA提取试剂盒。
3以提取的细菌基因组DNA为模板,PCR(聚合酶链式反应)扩增16SrDNA
细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAG-3′)分别位于大肠杆菌的16SrDNA的8~27位和1525~1541位核苷酸。
PCR的反应体系为25μL:
模板DNA(大约80ng),100umol/LdNTP,1.5mmol/LMgCl2,正向和反向引物各0.4umol/L和1UTaqDNA聚合酶。
PCR过程为95℃预变性5min后,进行下述30个循环:
94℃变性30s,55℃退火1min;
72℃延伸1.5min,最后72℃保温10min。
4℃保存。
PCR结束后,取2μLPCR产物在1%(m/V)琼脂糖凝胶中电泳。
电泳缓冲液为1×
TAE。
电泳结束后,用0.5ug/g溴化乙啶溶液对凝胶染色10min,回收溴化乙啶溶液,用蒸馏水冲洗凝胶后,在紫外灯下观察。
如果PCR扩增成功,则可见到相应大小为1.5kb的条带。
416SrDNAPCR扩增产物的纯化
浓缩16SrDNA的PCR产物:
16SrDNA的PCR产物中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇,混匀后置于-20度30min。
12000r/min离心10min,弃上清液。
自然晾干,加入15ul无菌双蒸水溶解DNA沉淀。
利用商品化的DNA回收试剂盒对浓缩后的PCR产物进行回收。
516SrDNAPCR扩增产物的克隆和测序送去上海生工测序。
616SrDNA序列同源性分析及结果鉴定
将测得的16SrDNA长度约为500bp的部分序列提交到GenBank,使用Blast程序来寻找与其有最大同源性的序列如果两者之间的16SrDNA同源性大于97.5%,则可认为它们属于同一个种。
6.1.2表型实验
(1)糖发酵的生化反应
(2)葡萄糖发酵终产物
6.1.3基因分型实验
6.1.3.1全基因组DNA脉冲场凝胶电泳(PFGE)的鉴定方法
按郭兴华主编的乳酸细菌现代研究实验技术中的操作进行。
6.1.3.1.1原理
凝胶上至少有两个电场方向,时间与电流大小也交替改变,使得DNA分子能够不断地调整泳动方向,以适应凝胶中不规则的空隙变化,达到分离大分子线形DNA的目的。
方法选用切割点较少的限制性内切核酸酶消化基因组DNA,产生的片段为10~80kb,条带数目5~20个,易于对比和分析。
6.1.3.1.2试剂和溶液
6.1.3.1.2.1重悬缓冲液:
10mmol/LTris碱,20mmol/LNaCl,50mmol/LEDTA(pH7.2)。
6.1.3.1.2.2低熔点琼脂糖溶液。
6.1.3.1.2.3裂解缓冲液:
6mmol/L、1mol/LNaCl,100mmol/LEDTA、1%十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、1mg/mL溶菌酶、20U变溶菌素(mutanolysin)。
6.1.3.1.2.4蛋白酶K缓冲液:
蛋白酶K(1mg/mL)溶解于100mmol/LEDTA,1%十二烷基肌氨酸钠。
6.1.3.1.2.50.04mg/mL苯甲基磺酰氟。
6.1.3.1.2.6TE溶液:
6.1.3.1.2.75×
Tris-硼酸(TBE)缓冲液:
Tris碱54g,硼酸27.5g,20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水至1L。
6.1.3.1.2.80.5ug/mL溴化乙锭。
6.1.3.1.3分析步骤
6.1.3.1.3.1DNA琼脂糖凝胶块制备
1待分型的乳酸细菌在适宜的培养基中生长至对数生长中期,加入青霉素使其终浓度为10~30ug/mL,继续培养2h。
23mL的培养物12000r/min离心10min收集细胞,用重悬缓冲液洗涤菌体2次后,悬浮在300uL的重悬缓冲液中。
3配制1.5%低熔点琼脂糖溶液。
4将等体积(各200uL)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中,4度放置30min让琼脂糖固化。
5将凝胶块自模具中取出并置入裂解缓冲液中,37度孵育过夜。
6将凝胶块放置于蛋白酶K缓冲液中,于50度保持18h。
7蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/LEDTA溶液中保存于4度。
8将凝胶块放入装有TE及0.04mg/m
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 保健食品 乳酸菌 评价