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抗体是较为复杂的蛋白分子,包含两条同样的重链和轻链。
每条抗体链都包含清晰的功能域,其中β-折叠以二硫键相连,形成β桶状。
二硫键对抗体的折叠和功能起着重要作用。
因此,无细胞蛋白表达体系需要提供能够形成二硫键的环境以表达功能抗体。
在过去的十年里,无细胞蛋白体系已经成功表达了二硫键蛋白。
最初无细胞蛋白体系表达二硫键蛋白时遇到的两个障碍是,第一,还原剂如DTT通常加入体系中以保持细胞裂解液在储存和翻译过程中的活性;
第二,缺乏活细胞内那样具有氧化还原条件的区室(如原核细胞中的细胞周质,真核细胞中的内质网)以供二硫键形成。
根据细胞裂解液的来源,采取了不同策略。
例如,大肠杆菌裂解液中添加入还原性和氧化型谷胱甘肽的混合物以建立合适的高氧化还原电位。
其他翻译系统主要采用烷基化试剂如碘乙酰胺对裂解液进行预培养以灭活内源性还原酶。
由于碘乙酰胺的使用可能会导致翻译活性的下降,因而发展了其它预处理方法如使用过量的氧化型谷胱甘肽。
进一步研究发现,加入外源性的酶,如真核蛋白二硫键异构酶(PDI),能够显著提高无细胞蛋白体系合成scFv片段的功能。
加入分子伴侣如DnaK,DnaJ,GroEL和GroES同样也是有益的,因为这些分子伴侣提高了无细胞蛋白表达系统合成的scFv和Fab的可溶性。
最成功的表达二硫键蛋白的大肠杆菌无细胞蛋白表达系统采取了多种策略共同使用的方法。
如,细胞裂解液由突变的大肠杆菌菌株制备,此菌株缺乏一种主要的内源性还原酶(Δ
gor
strain,KGK10);
细胞裂解液以碘乙酰胺和氧化及还原性谷胱甘肽预处理,建立氧化还原电位以适于二硫键形成。
并且,无细胞蛋白表达系统加入外源蛋白如二硫键异构酶C(DsbC)和PDI,促使二硫键的形成和异构化。
真核系统成功表达二硫键蛋白如tPA(1992年)使用的是兔网织红细胞体系,加入狗胰腺微粒体囊泡和氧化型谷胱甘肽。
随后,利用还原和氧化型谷胱甘肽和PDI,二硫键蛋白大肠杆菌碱性磷酸酶(两个二硫键)和人溶解酵素(四个二硫键)在昆虫系统也表达出来,并具有很好的功能。
然而,机体内蛋白的合成和折叠是在细胞的不同区域进行的,这就是所说的区室化现象,而前文中提到的各种策略就是试图在同一区室内(无细胞蛋白表达系统)完成蛋白的合成和折叠。
相反的是,在昆虫无细胞蛋白表达系统中,以草地贪夜蛾(Sf21)细胞裂解液为基础,目标蛋白合成后,能够进入另一个内源性区室中完成蛋白的折叠和翻译后修饰(如下图所示)。
这是由于昆虫的细胞裂解液包含有起源于内质网的内源性微粒体囊泡。
这些囊泡在细胞裂解液制备过程中形成,内质网破裂,重新组合形成多个较小的区室,成为微粒体囊泡。
如果目标蛋白与合适的信号肽融合,靶蛋白就可以进入这些囊泡的内腔。
因此,利用昆虫细胞的无细胞蛋白表达系统,膜蛋白可以合成并包埋入微粒体膜中。
这方面的研究已有很多报道。
原核无细胞蛋白表达系统表达抗体:
无细胞蛋白表达系统表达重组抗体乃至全长抗体的研究中,原核细胞是主要来源。
1997年,Ryabova和合作者一起发表了第一篇利用大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的详尽的报告,他们分析了不同添加剂对scFv的合成及其功能表现的效果。
在这篇报道里,PDI的加入将有功能的scFv的产量提高了三倍,而且,分子伴侣DnaK和DnaJ有效提高了可溶蛋白的量,但是并没有提高功能蛋白的量。
最后一点,各类添加剂的组合使用(还原和氧化型谷胱甘肽,PDI和分子伴侣)效果最好。
随后,其他一些研究小组陆续报道了大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的成功案例。
Jiang及其合作者于2002年报道了首例转录翻译偶联的大肠杆菌无细胞系统表达Fab的案例,并发现产量低的原因是内源性丝氨酸蛋白酶对靶蛋白的降解导致,他们随后采用缺乏丝氨酸蛋白酶的大肠杆菌突变体BW25113进行无细胞蛋白表达,解决了这一问题。
2008年全长IgG(鼠单克隆抗体MAK33)在大肠杆菌无细胞蛋白表达体系中的合成是一个里程碑意义的进展。
随后Yin等(2012)合成IgG1曲妥单抗以每升反应体系获得几百毫克的产量将前者超越。
很显然,无细胞蛋白表达体系可以将反应体系由毫升扩大到升,因此,Fab和全长抗体能够在标准的生物反应器(大至5L)以高产量(scFv~800ug/mL,Fab~250ug/mL,IgG~400ug/mL)进行合成。
2014年,利用大肠杆菌工程菌,使用分子伴侣优化的裂解液,全长抗体的合成进一步提高到每升反应液获得克级抗体的产量。
对于抗体合成,除了二硫键的形成,多个功能域蛋白的正确组装对于无细胞体系和细胞内的蛋白合成都是一个挑战。
由于密码子或者mRNA二级结构的因素,不同的模板以不同的速度进行翻译,因此对抗体重链和轻链比例的经验性优化是很重要的。
真核无细胞蛋白表达系统表达抗体:
1993年,兔网织红细胞来源的无细胞蛋白表达系统用来合成scFv-毒素融合蛋白。
除了大肠杆菌提取液,兔网织红细胞裂解液也是利用核糖体展示生产抗体片段的基本翻译系统。
2003年首例scFv抗体片段在麦胚来源的无细胞蛋白表达体系中合成。
发现用DTT缺乏的麦胚提取液加入PDI可获得最优的反应体系,1毫升batch系统中合成13ugscFv。
同年发展了基于昆虫sf21的真核翻译系统。
和其它真核系统相比,昆虫系统包含微粒体囊泡。
目标蛋白融合信号肽序列,可转运进微粒体囊泡进行蛋白的折叠,类似于体内环境。
2012-2014年间连续报道了两例成功利用昆虫无细胞蛋白表达系统合成功能scFv抗体片段的案例。
和其它成功表达二硫键蛋白的体系相比,昆虫系统只需要进行适当的优化即可:
除去还原性试剂DTT,加入谷胱甘肽,融合信号肽诱导靶蛋白转运进微粒体囊泡。
和其它体系相比,昆虫系统既不需要裂解液的预处理,也不需要加入其它外源性酶和分子伴侣。
无细胞蛋白表达系统对抗体的修饰:
蛋白与功能基团如荧光分子、亲和标签、药物分子等的连接在生物物理、生物技术和生物医学应用中具有特殊的意义。
例如,抗体-药物复合物有助于靶向癌细胞,降低药物副作用,提高治疗效果。
抗体与细胞因子或免疫刺激多肽连接可被用于疫苗(Kanter,2007)。
在这项研究里,利用无细胞蛋白表达体系合成的两个scFv融合蛋白成功用做抗鼠B细胞淋巴瘤的疫苗。
无细胞蛋白表达系统在生产个性化疫苗方面表现出了巨大潜力。
将来,我们可能能够利用PCR直接扩增病人自己的免疫球蛋白可变区段,生产个性化疫苗。
无细胞蛋白表达体系还可以为目标蛋白共表达并标记上一个或多个非必须氨基酸。
在这方面,体内不可避免的会有很多限制,特定修饰的氨基酸可能会表现出毒性或者根本不能进入细胞,体外的开放系统不受氨基酸类似物毒性的限制。
无细胞蛋白表达系统在抗体合成方面的发展很快。
从第一个scFv的全面报道到全长IgG分子的合成,间隔不到11年的时间。
在这样的发展速度下,相信对于目前仍然存在的问题,很快就会有解决方案。
浅述蛋白质分离纯化的新技术
摘要:
本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术,综和近年来国内外的一些研究结果,结合实际应用的例子,分析了各种分离纯化方法的优点,同时指出其不足之处。
文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。
关键词:
分离纯化蛋白质进展
生物技术的发展非常迅速,基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术,已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。
和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。
上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。
本文主要综和近年来国内外的研究结果,介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。
2.蛋白质的分离纯化方法:
2.1浊点萃取法(CPE):
2.1.1概念及原理:
浊点萃取法(cloudpointextraction,CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术,它不使用挥发性有机溶剂,不影响环境。
它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础,改变实验参数引发相分离,将疏水性物质与亲水性物质分离。
目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。
CPE法除了利用增溶作用外,还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。
溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相:
一为表面活性剂相(约占总体积的5%);
另一为水相(胶束浓度等于CMC)。
外界条件(如温度)向相反方向变化,两相便消失,再次成为均一溶液。
溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白,与表面活性剂的疏水基团结合,被萃取进表面活性剂相,亲水性物质留在水相,这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。
图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。
温度的改变,引起水化层的破坏,增强了表面活性剂的疏水性。
2.1.2蛋白质分离纯化中的应用:
CPE法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体,还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步,与色谱方法联用。
另外,CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。
Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。
虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行,但商品离心分离器用于CPE的效率和容量仍需进一步研究。
而且,他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大,体系两相间密度差较小,表面张力较小,含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂,操作较难。
表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。
(1)CPE法用于分离纯化膜蛋白
膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水,抽提内嵌膜蛋白时,既要削弱它与膜脂的硫水性结合,又耍使它保持硫水基在外的天然状态,较难分离纯化。
由于表面活性刑具有两亲性,它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。
增溶时,膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离,又保持了膜蛋白表面的废水结构。
相分离后,膜蛋白与表面活性剂共同析出,与亲水性蛋白质分离。
所以,CPE法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。
(2)与其它分析技术的联用
CPE可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法,提高检出灵敏度。
表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上,易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合,可以直接进样。
但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。
将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。
对于CMC>1mM的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法,但操作时间较长(24h左右)。
对于CMC较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去,如凝胶柱、毛纫管柱等,分离出的表面活性剂可以再利用,也可以作焚烧处理。
但CPE作为HPLC的样品前处理方法有
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