斑点杂交条件的建立及优化Word格式.docx
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glycosyltransferase;
gene
基因的表达分析研究是分子生物学实验中较为常用的手段,主要有Northernblot和斑点杂交(dotblot)等,因斑点杂交无需转膜,且DNA或RNA相对固定在一定的区域内,实验要求相对简单,因此斑点杂交更易为实验者所接受。
目前一般均用商品化的试剂盒,但其价格昂贵,不是一般实验室所能普及,因此我们采用自配的试剂建立并优化了一套斑点杂交方法,无需特殊设备,经济简便,结果可靠。
1材料与方法
多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因的获得。
取pp-GalNAcT2克隆载体转染DH5α工程菌,筛选白色阳性克隆,抽取质粒,用M13正向、反向引物进行克隆PCR,M13Forward5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′,M13Reverse5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′,电泳鉴定结果,可见约1200bp左右的条带。
即获得相应的ppGalNAc-T2cDNA片段。
采用T2特异的寡核苷酸探针进行斑点杂交法条件的建立及优化探针序列5′-GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAAGAA,与ppGalNAc-T2cDNA序列互补,长31bp。
探针合成及探针5′端生物素标记均由上海生工生物工程公司完成。
斑点杂交操作程序
(1)以上述所得pp-GalNAcT2的cDNA片段以1NNaOH和200mM的EDTA对比稀释,使成NaOH和10mM的EDTA的终浓度。
(2)把稀释的pp-GalNAcT2的cDNA片段在100℃变性5min,迅速置冰,冰冷10min以上。
(3)膜用灭菌双蒸水浸泡10min,悬空晾干。
(4)每点2μl把pp-GalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上,湿膜在紫外灯下照2min,取出让膜干燥。
(5)杂交时以2×
SSC浸膜5min,装入杂交袋,根据VECTORNIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。
以每100cm2膜加20ml的预杂交液于42℃预杂交2~3h。
(6)弃去预杂交液,在杂交液中加入适量探针,以每100cm2膜加10ml的杂交液于42℃杂交过夜。
(7)用足量洗涤液1于42℃洗涤2次,再用洗涤液2于55℃严谨洗涤2次。
(8)用蒸馏水淋洗膜2~5min,然后用封闭液封闭。
(9)倒出封闭液,加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素-碱性磷酸酶,37℃孵育30min。
(10)洗涤液3在37℃洗膜2次,检测缓冲液平衡,再以每10ml检测缓冲液加66μlNBT和11μlBCIP(均购自上海华舜生物工程有限公司)的显色液显色。
(11)显色结束后以TE终止,用扫描仪获取图像。
斑点杂交建立及优化程序
(1)尼龙膜上不点任何样品,以下述条件行假杂交反应。
杂交液中探针的终浓度为:
200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml;
酶的稀释比例为:
1/400、1/800、1/2000、1/5000;
封闭液中BSA的终浓度为:
2%,封闭2h;
杂交后洗涤液1和2分别洗2次,每次1h;
封闭后洗涤液洗2次,每次1h;
检测缓冲液平衡1h;
显色30min。
以所获得的最佳本底,在尼龙膜上点上pp-GalNAcT2的cDNA片段,其余条件不变,封闭液中BSA的浓度设计成2%、3%和5%三梯度进行杂交反应
以所获得的最佳条件,改进以下条件:
①杂交后洗涤时间每次1h;
每次30min;
每次10min;
②封闭液封闭时间2h;
;
50min;
③封闭后洗涤时间由每次1h;
每次40min;
每次20min;
④检测缓冲液平衡时间由1h;
30min;
10min;
⑤显色以出现清晰的阳性信号,本底最低为尺度,一般在15min左右,时间延长本底升高。
斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp-GalNAcT2的表达差异NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC-7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所;
RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUCMixDNAmarker和ladder购自Invitrogen公司,六随机引物购自Takara公司。
实验所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白引物采用Genetyx软件设计,并经GenBankBlast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。
β-MG引物序列为
F:
5′-CTCGTGCTACTCTCTCTTTC-3′
R:
5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′
预期扩增产物长度330bp。
ppGalNAc-T2引物为
5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC-3′
5′-CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC-3′
预期扩增产物长度为668bp。
采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株RNA,测A260/A280比值和电泳图谱鉴定抽提完整性,测A260定量,六随机引物逆转录制作cDNA。
倍比稀释点膜,用pp-GalNAcT2特异的寡核苷酸探针与膜杂交;
同时以上述获得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株cDNA加pp-GalNAcT2和β-MG正反向引物行RT-PCR来验证斑点杂交结果。
2结果
(1)尼龙膜上不点任何样品所进行的假杂交反应结果如图1所示,可见以杂交液中探针的终浓度为10ng/ml,酶的稀释比例为1/5000时本底最低;
以此条件,在尼龙膜上点上pp-GalNAcT2的cDNA片段,封闭液中BSA的浓度设计成2%、3%和5%三梯度,其余条件不变的杂交反应结果如图2所示,可见以5%的BSA封闭效果最佳;
再以上述确立的条件改进杂交反应各步的时间,以简化实验,如图3所示,可见条件2和条件3体系下的结果都是可以接受的,但条件3更为简化。
(2)以上述确立的杂交反应的条件用斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株GalINAcT2的表达差异,以验证所确立的条件的实际可行性,结果如图4所示,pp-GalNAcT2的表达水平依次为K562白血病细胞胃癌细胞SGC7901NB4白血病细胞,在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。
同时再行RT-PCR确证斑点杂交的结果,如图5,6所示,与斑点杂交结果基本一致。
3讨论
我们参照分子克隆[1]和Superarray[2]操作手册,设计并改进预杂交液和杂交液。
由于采用带正电荷的尼龙膜为支持介质,在碱性条件下更有利于DNA与膜结合,而预杂交的目的是封闭膜上的非特异性结合部位,因此预杂交液采用的PB配制并调终体积;
而杂交液中的探针要尽量减少与膜的非特异性杂交,因此杂交液用水来调终体积,pH值控制在左右。
同时,对杂交过程中所涉及的每一个步骤及试剂的配制,我们都进行优化,最终所确立优化过程采用自配的预杂交液和杂交液,杂交液中探针浓度为10ng/ml,杂交后洗涤液1和2各洗涤2次,每次10min,5%的BSA封闭液封闭50min,封闭后加酶稀释比为1/5000,封闭后洗涤液洗2次,每次20min,检测缓冲液平衡10min,显色以出现阳性信号,本底最低为标准。
图1不同的探针及酶浓度进行假杂交反应A:
探针浓度为200ng/ml,酶浓度为1/400B:
探针浓度为100ng/ml,酶浓度为1/800C:
探针浓度为50ng/ml,酶浓度为1/2000D:
探针浓度为10ng/ml,酶浓度为1/5000
图2三种不同BSA浓度显色对比(A:
BSA为5%;
B:
BSA为3%;
C:
BSA为2%)
图3不同洗涤、封闭和显色时间的显色对比A:
条件1;
条件2;
条件3
图47901、NIH3T3、NB4和K562四种细胞的斑点杂交图
图示1~6稀释比例为1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32,每点cDNA上样量为12μl,原始浓度折算成RNA为μg,采用寡核苷酸探针与之杂交
图5不同细胞株pp-GalNAcT2的RT-PCR电泳图谱,其中1:
NIH3T3细胞;
2:
SGC7901细胞;
3:
NB4细胞;
4:
K562细胞;
M:
marker;
MG:
β微球蛋白(内对照)
Fig6RT-PCRanalysisofpp-Ga1NAcT2expressioninSGC7901,K562,NB4andNIH3T3cells
为进一步检验膜杂交条件的可行性,我们用胃腺癌SGC7901细胞、白血病K562、NB4细胞和NIH3T3成纤维细胞的cDNA以一定的稀释比进行斑点杂交,检测pp-GalNAcT2在这四种细胞中的差异表达,得到的相对表达水平为:
K562白血病细胞胃癌细胞SGC7901NB4白血病细胞,在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。
pp-GalNAcT2主要表达于富含粘蛋白的组织细胞中[3],一般说来,能分泌较多粘蛋白的细胞pp-GalNAcT2有较高表达,如正常胃和大肠粘膜,胃癌细胞株SGC7901中pp-GalNAcT2mRNA的表达很高是可以理解的;
NIH3T3是一种成纤维细胞,来源
于非上皮组织,不分泌粘蛋白,所以其pp-GalNAcT2的表达甚低。
K562和NB4均是白血病细胞,其pp-GalNAcT2表达也较高,其确切的生物学意义有待阐明。
虽然我们采用了严谨的洗涤条件但也不排除杂交液中的探针与cDNA之间发生非特异性杂交,因此对每种细胞的cDNA行pp-GalNAcT2特异的RT-PCR,以β-MG为内对照,对所得的T2和β-MG条带扫描定量,比较四种细胞T
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- 关 键 词:
- 斑点 杂交 条件 建立 优化