基因分离克隆和功能鉴定Word格式.docx

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基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。

而PCR技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。

1.基因的分离克隆

基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。

分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。

基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。

基因的分离克隆主要方法

基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。

一般方法是先建立文库（基因组文库或cDNA文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。

而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA序列，则可用这个DNA序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。

先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分（注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；

得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分（即探针序列是重叠的，共有的。

也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。

于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。

通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。

以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。

功能性克隆

通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。

由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。

若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。

除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。

当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA文库的筛选；

或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA3’端poly—A序列指导合成poly—T的3’端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。

同源性序列克隆技术

随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：

生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。

基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。

对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物

种的DNA文库。

同源性序列克隆技术自提出以来，受到国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题值得重视和思考：

①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。

②由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。

③基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。

因此对PCR扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。

表型克隆技术

细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。

差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。

分离差异表达基因的3种基本方法为：

差式筛选、扣除杂交、差异展示反转录。

差式筛选法

差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取

mRNA，反转录为cDNA，并构建Ts的cDNA文库，分别将从TS和RS中提取mRNA制成cDNA探针，分别用TS和RS的eDNA探针与TScDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与Ts杂交，而不与RS杂交的克隆即为TS特异表达的克隆。

此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。

扣除杂交

扣除杂交则是用TS提取的mRNA反转录成cDNA探针与Rs的过量mRNA或cDNA杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS的mRNA或cDNA，将不形成杂交体的TS的eDNA纯化富集，扩增，建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库。

但此法回收cDNA量有限，重复性差，灵敏度低。

DDRT—PCR

DDRT—PCR则是分别用Ts和RS的总mRNA作模板，利用12个可能的锚定引物T11MN锚定mRNA的olyA末端，借助逆转录酶合成cDNA第一链，得mRNA／cDNA，再用相同的3’锚定引物和5’端随机引物分别扩增TS、RS的mRNA／cDNA，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。

它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的mRNA。

分析2种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。

代表性差示分析法（RDA

代表性差示分析法（RDA可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因，具体过程如下：

①制备扩增子。

提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA即test。

ereDNA和drivercDNA。

然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR扩增。

②扣除杂交。

去除接头后仅对tester片段加上新的接头，用过量的drivercDNA与之杂交退火，将形成三种产物：

tester／tester、tester／driver、driver／driver。

③特异性片段的扩增。

末端补平后，加入新接头引物进行PCR。

3种产物中仅自身退火形成的tester／tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester／driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，Driver／driver无引物配对不扩增。

然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子，再进行PCR富集特异表达cDNA片段。

④对特异片段进行克隆，通过FISH等技术进一步分离特异表达基因。

抑制性差减杂交PCR法（SSH

SSH的基本流程如下：

①第1次杂交。

提取TS和RS的mRNA反转录为testereDNA和drivereDNA，用RsaI或Haem酶切成平头末端cDNA，分成均等2份，分别加不同的接头，再分别与过量的drivercDNA杂交，将形成4种产物：

a，单链testercDNA、b，自身退火的tester／tester双链、c，异源退火tester／driver双链、d，drivercDNA。

②第2次杂交。

合并2份杂交产物，加入新的变性drivercDNA退火、杂交，这次除了a、b、c、d4种产物外还形成产物e，e是tester自身退火形成，但两端带不同接头。

末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a和d无扩增。

b由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增，c仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e两端可配不同引物而呈指数扩增。

④特异性片段e克隆，并进一步分离差异表达基因。

该法通过2次杂交和2次PCR，使假阳性率可降到6％，且灵敏度高。

用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因，效率大增。

交互差减差异RNA显示（RSDD

RSDD的主要过程如下：

①交互差减。

分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的mRNA，反转录为cDNA，并构建cDNA文库。

将这2个文库进行交互差减得到A减B和B减A的2个差减cDNA文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒cDNA文库。

②差异显示。

用3’锚定引物和5’随机引物对2个差减文库提取的DNA分别进行PCR扩增，将扩增产物用5％序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异DNA，再次扩增后，获得富集的差异表达片段。

③表达分析。

采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的真伪。

反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜，分别与来自A、B细胞系的总mRNA经反转录制备的32P标记的cDNA第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。

④对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。

RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因，它结合了DDRT—PCR和扣除杂交的优点，减少或消除了共有序列，使序列胶上条带清晰度增加，并使低丰度序列得到富集，降低了假阳性率，且RSDD仅用较少的引物进行逆转录PCR就可分析全部差异表达基因，但RSSD并不能完全杜绝假阳性。

Kang等用RSDD法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因（PEGene和抑制肿瘤发展的基因（PSGene。

图位克隆技术

随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位，在90年代初图位克隆技术也应运而生。

其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN文库（如YAC、BAC或Cos。

mid文库，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行（chromosomewalking逐步逼近候选区域或通过染色体登陆（chromosomelanding的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。

定位克隆理论上适用于一切基因。

但也存在应用上的一些不足：

如果要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低，因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。

转座子标签法（transposontagging

转座子（Transposon是从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米内发现的。

随后的研究表明，在生物界内转座子是普遍存在的。

并在生物的遗传进化方面有重要作用。

转座子标签技术克隆基因的基本原理是：

利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点。

以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因，如果某基因的突变是基于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可以从变异株的基因组中筛选