酵母杂交技术原理及应用_精品文档PPT课件下载推荐.ppt
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序列克隆法根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因表达序列标签法分离目的基因ESTs基因表达序列分析法返回利用差示分析法分离目的基因克隆mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术抑制性减法杂交技术返回酵母双杂交酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子反式转录激活因子的参与。
80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式组件式的,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结结合结构域合结构域(DNAbindingdomain,简称为简称为BD)和转录激活结构域转录激活结构域(activationdomain,简称为简称为AD),BD可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游;
AD可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。
单独的BD虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。
不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能(如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录)如果诱饵蛋白诱饵蛋白和靶蛋白靶蛋白能够相互作用,那么GAL4DNA结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用,从而激活lacZ报道基因的表达。
所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。
1)将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质已知蛋白质Baitprotein(诱饵蛋白)的基因构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。
2)将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。
同时将上述两种载体转化改造后的酵母改造后的酵母(这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生既不能产生GAL4,又不能合成,又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。
)3)当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因酵母基因组中的报告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1,从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。
将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来,从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。
主要有二类载体:
a含DNA-bindingdomain的载体;
b含DNA-activatingdomain的载体。
这二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence),而GAL4-ad没有。
因此,在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用binding-domain基因有:
GAL4(1-147);
LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
常用的activating-domain基因有:
GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株报道株。
报道株指经改造的、含报道基因含报道基因(reportergene)的重组质粒的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞酵母细胞,酵母细胞作为报道株具有许多优点:
1易于转化、便于回收扩增质粒。
2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如GAL4-bd,LexA-bd);
另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad,VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为:
1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合,构建成诱饵质粒诱饵质粒。
2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合,构建成文库质粒文库质粒。
3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
4、酵母细胞中,已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用,但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用,则可激活报告基因的转录;
反之,则不能。
利用4种报告基因的表达,便可捕捉到新的蛋白质。
酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。
主要是由于:
采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达杂合蛋白过量表达。
信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。
杂交蛋白间稳定度杂交蛋白间稳定度可被激活结构域激活结构域和结合结构域结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统的优点和特点酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:
作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。
酵母双杂交系统的应用1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能当我们将已知基因作为诱饵,在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白,从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体,并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段,并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较,研究与已知基因在生物学功能上的联系与已知基因在生物学功能上的联系。
另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。
酵母双杂交系统的应用2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫(ELISA)、免疫共沉淀(CO-IP)技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。
而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。
对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法,阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
例如:
Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病,研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶(NS5)与拓扑异构酶NS3,以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。
研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。
如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用,就可以阻止RNA病毒的复制,从而达到治疗这种疾病的目的。
酵母双杂交系统的应用4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。
基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。
通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列,HUA等人利用酵母双杂交技术,将所有已知基因和EST序列为诱饵,在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白,从而找到基因之间的联系,建立基因组蛋白连锁图。
对于认识一些重要的生命活动:
如信号传导、代谢途径等有重要意义酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法,有多方面的应用,但仍存在一些局限性。
双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生假阳性结果。
在酵母双杂交的基础上,又发展出了酵母单杂交、酵母单杂交、酵母三杂交酵母三杂交和酵酵母的反向杂交母的反向杂交技术。
它们被分别用于核酸和文库蛋白之间核酸和文库蛋白之间的研究、三种不三种不同蛋白之间同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用两种蛋白相互作用的结构和位点。
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来,酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究,而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测,分析DNA、蛋白之间的相互作用、蛋白之间的相互作用,以研究真核细胞内的基因表达调控。
酵母单杂交酵母单杂交用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子转录因子。
研究表明GAL4的DNA结合结构域结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);
而转录激活结
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