过柱的实验方法和技巧文档格式.docx
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二:
关于柱子的尺寸
应该是粗长的最好。
柱子长了,相应的塔板数就高。
柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。
现在见到的柱子径高比一般在1:
5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×
20cm的柱子);
如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。
三:
关于无水无氧柱
适用于对氧,水敏感,易分解的产品,可以湿柱,也可以干柱。
不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。
也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。
至于是加压、常压、减压,随需而定。
因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。
如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。
像我以前过一根无水无氧柱,需要六个schlenk,现在只一个就能把所要的全收集到。
无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。
因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。
而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。
听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。
哪位做过可以提出来大家参详参详。
四:
关于湿法、干法上样
湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。
很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系。
可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是比较好的固体才会发生,这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,如果不能重结晶,那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。
有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等,会随着溶剂一起走,显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。
样品和硅胶的量有一种说法是1:
1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有吸附在硅胶上)。
五:
溶剂的选择
当然是最便宜,最安全,最环保的了。
所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。
文献中有写用正己烷的,太贵了,除非特别需要不要用不然银子哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因为极性很小,有时还是非它不可。
乙醚也可以用,但是就是容易睡觉,注意保持清醒别让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了。
二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷的时候会好一些。
甲醇据说能溶解部分的硅胶,所以产品如果想过元素分析的话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等。
其他的溶剂用的相对较少,要依个人的不同需要选择了。
由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是用10升或25升的塑料桶装的,就要注意这些工业品的纯度是较低的。
经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质,其他的杂质就可想而知了,所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。
当然过原料时就可以免去这一步了,反正下面还有提纯的方法。
另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。
这里要注意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适,正好极性越来越大了。
在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常压,因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来,常压时就会减少这种现象,如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。
六:
关于操作问题
1、装柱
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采用四氟节门的。
干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子装实就行。
装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。
书中写的都是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压气泡就全下来了。
当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。
但是柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废!
2、加样
用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。
加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm就够了),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。
3、淋洗剂的选择
感觉上要使所需点在rf0.2~0.3左右的比较好。
不要认为在板上爬高了分的比较开,过柱子就用那种极性,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式的比较:
0.6/0.8一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。
4、样品的收集
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。
所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。
这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。
这时可以采用氧化铝作固定相。
另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,可能一根就收到了三个样品,wuwu。
如果都用小试管那工作量又太大。
5、最后的处理
柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本就没了,必要时进行重结晶。
另外,再过柱的时候,有时会出现气泡,一是和使用的溶剂有关,如果是易挥发的溶剂,如乙醚、二氯甲烷等,在室温稍高的情况下,很容易出现这种现象,因此,在室温高的时候,可以选择沸点较高,挥发相对小的溶剂。
还有,使用混合溶剂时,使用的两种溶剂的沸点应该相差不大,如:
乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30-60的石油醚。
二是:
不论是用带砂板的还是塞棉花的,在装柱之前,都要将空气用加压的方法将空气排干,这样就可避免柱中有空气!
过柱子需要耐心,不要着急.
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极性小的用乙酸乙酯:
石油醚系统
极性较大的用甲醇:
氯仿系统
极性大的用甲醇:
水:
正丁醇:
醋酸系统
拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
硅胶柱层析
下面介绍我现在惯用的方法:
匀浆法。
1。
称量。
200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;
如果极难分,也可以用100倍量的硅胶H。
干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。
2。
搅成匀浆。
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。
如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;
如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。
如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。
氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。
如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。
3。
装柱。
将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。
随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。
4。
压实。
沉降完成后,加入更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定。
柱床约被压缩至9/10体积。
无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5。
上样。
干法湿法都可以。
海沙是没必要的。
上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。
然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。
6。
过柱和收集。
柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。
太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。
收集的例子:
10mg上样量,1g硅胶H,0.5ml收一馏分;
1-2g上样量,50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。
7。
检测。
要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8。
送谱。
收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。
如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手段。
可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂,使两相邻物质Rf值之差最大化
2.将柱子必须装平整、均匀
3.考虑有限柱填料的吸附量
4.可考虑用剃度法分开并洗脱
关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。
柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是
样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米,而样品就有二
厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只
有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多
的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,
不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。
现在见到的柱子径高比一般在1:
5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选
择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质
相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×
20cm的柱子
);
如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也
可以减小淋洗剂的极性等等。
真空液相层析即vacuumliquid
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