土鸡肠道产消化酶细菌的研究doc 大学毕业设计Word文档下载推荐.docx
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摘要1
Abstract1
1绪论2
1.1信鸽2
1.2脂肪酶的概述2
1.3脂肪酶的研究进展2
1.4信鸽分离菌产脂肪酶的研究意义3
2实验材料3
2.1实验原料3
2.2药品和试剂3
2.3实验用品3
2.4主要设备及仪器3
3实验方法4
3.1分离计数的过程4
3.1.1鸽肝、鸽肺稀释液的制备4
3.2菌落特征观察的过程5
3.2.1、观察倍比稀释后平板中长出的菌落特征。
5
3.2.2细菌和酵母菌菌落的观察和识别5
3.2.3菌落归类5
将记录好的带有编号的未知菌落的各项特征,结合各类微生物特点的,分别了解各菌株的外貌特征并归入相应的大类中。
3.3四区划线的过程6
3.3.1、试管斜面划线6
3.3.2、平板的四区划线6
3.4革兰氏染色的方法7
3.5产脂肪酶能力检测的过程8
4实验结果8
4.1分离计数的结果8
4.2菌落特征观察10
4.3四区划线的结果12
4.4革兰氏染色结果12
4.5产脂肪酶能力检测结果16
5讨论与小结17
参考文献20
致谢21
12株信鸽分离菌产脂肪酶能力初步研究
摘要
以信鸽的肝、肺为材料,分离出细菌12株。
通过革兰氏染色结果表明:
9株为革兰氏阴性菌,3株为革兰氏阳性菌。
对它们的产脂肪酶能力进行研究,结果表明12株信鸽分离菌产脂肪酶菌株共6株,占总菌株数的50%,其中鸽肝5株、鸽肺1株。
产脂肪酶能力最强的是肝4,水解圈与菌落直径比为4.5。
关键词:
鸽肝;
鸽肺;
脂肪酶;
分离菌。
PreliminarystudyofTwelepigeonsisolatedbacteriatoproducelipaseability
Abstract
Usingthepigeonsliverandlungsasmaterialtoseparationofbacteria30strains.Gramstainingresultsshowedthat24strainsofgram-negativebacteria,6strainsofgram-positivebacteria.Andamylasetheabilityoflipase.Resultsshowthatthisexperimentfrominliverandlungs30strainsofbacteriawereisolatedfrompigeons,6strainsproducinglipase,accountingfor50%ofthetotal,including5strainsisfromliverand1strainsisfromlung.Amongthemoneofthebestisliver4thatabilityofproductinglipase,hydrolysisandcolonydiameterratioof4.5.
Keywords:
pigeonliver;
pigeonlung;
lipase;
isolate.
1绪论
1.1信鸽
鸽是鸽形目鸠鸽科数百种鸟类的统称。
鸽属,学名Columba,是鸠鸽科的一属,俗称鸽子;
包括各种小型中型和大型的鸽子,其中有我们今天常见的鸽子,即原鸽。
是一种善于飞行的鸟,品种很多,羽毛的颜色也多,主要以谷类为食。
鸽子翅长,飞行肌肉强大,故飞行迅速而有力。
鸽栖息在高大建筑物上或山岩峭壁上,常数十只结群活动,飞行速度较快,飞行高度较低。
在地上或树上觅食种子和果实。
在山崖岩缝中用干草和小枝条筑巢。
巢平盘状,中央稍凹,一般每窝产卵2枚。
卵白色。
一年可以产卵5-8对。
家鸽就是由原鸽驯化的。
从众多的各具特点的野生原鸽,进化到多种多样的家鸽,说明今天的家鸽是一种多源性的产物。
1.2脂肪酶的概述
脂肪酶(lipase),又称甘油酯水解酶,是一类广泛存在于微生物及动植物细胞中的特殊酯键水解酶,可以催化水解甘油三酯、单甘脂、甘油及游离脂肪酸。
在油水界面上还能催化脂化、转酯化、甘油解和氨解等多种反应。
脂肪酶参于的生化反应条件较缓和、副产物少的优点,反应通常具有高度的立体异构专一性和化学选择性。
对环境污染小,成本低。
因此广泛运用于食品粮油、精细化工、生物能源、环境保护医疗防治以及分子生物学研究等方面。
1.3脂肪酶的研究进展
脂肪酶是科研研究中最早被关注的酶类之一,已经有100多年的历史了。
自然界中脂肪酶是广泛存在的,特别是微生物和动植物的组织中。
微生物产脂肪酶有种类繁多、不被季节气候等环境条件的因素所影响、产酶时间短,发酵产物比较单一等优点。
因此,脂肪酶的研究具有很高的应用价值。
近年来越来越得到各国科研人员的广泛注意,在理论上的发展非常迅速,极大的带动了脂肪酶在工业生产实际中的应用。
1.4信鸽分离菌产脂肪酶的研究意义
脂肪酶的研究具有很高的应用价值,我们对多种微生物产脂肪酶也有了一定了解,但由于脂肪酶生产条件较为复杂,成本较高,所以使得动物脂肪酶的研究也慢慢提上舞台。
到目前为止,对动物脂肪酶来说,在脂肪酶产生菌的筛选及产脂肪酶能力的研究还比较慢,所以了解不同生物细菌产脂肪酶能力是至关重要的。
本实验就是以信鸽的肝和肺为材料初步了解信鸽分离菌产脂肪酶能力。
2实验材料
2.1实验原料
本研究所采用的原料有:
信鸽的肺、肝。
2.2药品和试剂
10%盐酸溶液、无菌水、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、酵母粉、氯化钙、吐温-80、10%NaOH、结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。
2.3实验用品
牛角勺、研钵、玻璃棒、pH试纸、衣棉、烧杯、平板、试管、1000mL刻度搪瓷杯、标签纸、纱布、1mL无菌吸管、记号笔、酒精灯、试管架、锥形瓶、打火机、接种环、牙签、报纸、棉线、载玻片、盖玻片、镊子、1mL移液管等基本实验用品,枯草杆菌,大肠杆菌。
2.4主要设备及仪器
电子分析天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子显微镜、恒温箱、干燥箱。
3实验方法
3.1分离计数的过程
3.1.1鸽肝、鸽肺稀释液的制备
1、取鸽肝、鸽肺样品
取拉稀信鸽新鲜鸽肝、鸽肺样品,放入4摄氏度的冰箱中暂存。
2、培养基的制备
成分:
牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.0。
配好后分装入锥形瓶中,用报纸包扎好后,再放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
制好备用。
3、样品稀释液的制备
分别准确称取待测样品各10g,用剪刀剪碎,再放入研钵中充分研磨,直到样品变成糊状,再用无菌吸管吸取糊状鸽肝1mL放入装有9mL无菌水的试管中,即成10-1稀释液;
吹吸3次,让菌液混合均匀,再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,即成10-2稀释液;
以此类推,连续稀释,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释液。
鸽肺同法。
用稀释平板计数时,采用10-5、10-6、10-7稀释度。
4、平板接种培养(涂抹平板计数法)
先将培养基溶化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,将无菌平板编上,肝10-5、肝10-6、肝10-7号码,每一号码设置3个重复,用无菌吸管按无菌吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度是需要将刮铲灼烧灭菌。
将涂抹好的平板平放于桌上20min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数。
计算结果时,从接种后的3个稀释度中选择一个合适的的稀释度。
求出每克菌剂中的含菌数。
鸽肺方法同上。
3.2菌落特征观察的过程
仔细观察平板中的菌落,并记录好菌落大小、形成方式、表面形态、边缘干湿、颜色、光泽、厚度以及透明度等特征。
3.2.2细菌和酵母菌菌落的观察和识别
细菌和酵母菌都是单细胞微生物,菌落由菌体堆积而成,有共同的特征,较湿润、光滑、透明、易挑起、菌落的正反面、边缘和中央颜色一致,质地较均匀。
但两者也有区别,细菌的菌落较小、较薄、较湿润、颜色多样,较有“细腻”感。
有鞭毛的细菌其菌落较扁平、边缘不规则。
有芽孢的细菌菌落粗糙、多皱、不透明。
酵母菌的菌落比细菌的大、厚、外观较稠、较不透明。
放线菌与霉菌菌落的观察放线菌和霉菌的菌落都呈丝状,在固体培养基上都有基内菌丝和气生菌丝的分化,因此菌落由菌丝相互缠结而成、外观干燥、不透明,呈蛛丝状或绒毛状,菌落与培养基结合紧密不易挑起。
菌落、孢子常分泌不同色素,使菌落的正反面、中央和边缘表现不同的颜色。
两者也有区别:
放线菌菌丝比霉菌菌丝细,生长后期分化的孢子丝有大量的孢子,因而它的孢子比霉菌小儿密,表面呈干粉状,霉菌的菌丝比放线菌粗长,菌丝快而疏松。
3.2.3菌落归类
3.3四区划线的过程
3.3.1、试管斜面划线
将装有牛肉膏蛋白胨的试管斜面编号肺2,肺4,肝1,肝2,肝3,肝4,肝5,肝6,肝7,肝8,肝9,肝10。
再用接种环挑选鸽肝平板接种后的板中的小个的菌落,在标有鸽肝1的牛肉膏蛋白胨试管斜面划“之”字形,再接着挑鸽肝平板接种后的板中的小个的菌落,在标有鸽肝2的牛肉膏蛋白胨试管斜面划“之”字形,依次如此,鸽肺试管中的菌要从鸽肺的平板中挑选菌。
待试管全部划完后,再放入37℃的恒温培养箱中培养24h。
3.3.2、平板的四区划线
平板的四区划线分离法是指把微生物群体用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单个菌落,以达到保种所需要的纯度。
实验步骤:
1、先倒好营养琼脂的培养基平板冷却待用。
2、做分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。
各区域之间的交角为120°
左右(平板转动一定角度约60°
),以便充分利用整个平板的面积,而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行,并可避免两区线条相接触。
3、划线操作
(1)挑取含菌样品:
用灭菌好的接种环,挑取少量肝1试管斜面上的菌种
(2)划A线:
将平板置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板平行于桌面有培养基一面向着酒精灯,右手拿接种环先在A区划3条连续的平行线,画完A区后立即烧掉接种环上残菌,
(3)划其他区:
使B区转到上方,并将将冷却好的无菌的接种环通过A区(菌源区)将军菌带到B区,随即划出3条致密的平行线,再从B区做C区的划线,最后做C区到D区的划线,D区的线条应与A区平行,但不能与A、B区接触,随即将皿底放入皿盖中,烧去接种环上的残菌。
(4)恒温培养:
将划线平板倒置,于37℃恒温箱中培养,24h后观察。
(5)其他试管斜面也依次进行此操作。
3.4革兰氏染色的方法
3.4.1活化准备
由于四区划线已将细菌分离纯化了,挑选纯化后的细菌于试管进行平板活化,再从活化后的平板中的菌中,挑菌进行试管活化。
备用。
3.4.2革兰氏染色步骤
1、涂片:
用消毒棉球擦拭双手,用镊子取干净载玻片两块,在一块载玻片的左、
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