mtDNA异质性及其法医学应用Word下载.docx
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这种同一
个体mtdna出现两种或两种以上的碱基序列的现象
称为异质性(heteroplasmy)。
121其在人体的存在表现为
同一个体不同组织、同一组织不同细胞或同一细胞不
同线粒体之间存在不同的mtdna序列。
一
、mtdna异质性形成的可能机理
mtdna异质性发生机制至今还不是很清楚
hauswi~h和laipis(1982)在研究牛线粒体dna多态
性时发现异质性线粒体dna在卵母细胞和胚胎早期
发育阶段发生快速分离的现象,从而提出线粒体dna
遗传的瓶颈理论。
[31后来人们多用该理论来解释
mtdna异质性的形成原理。
mtdna异质性的本质是突变.即突变型和野生型
mtdna以不同比例共存,其发生与mtdna拷贝数多、
不对称复制及缺乏校正修复机制等密切相关。
瓶颈理
论认为:
卵母细胞在分化成卵细胞及形成受精卵的过
程中,卵母细胞和受精卵中数千个mtdna子集合群
体(不同序列mtdna混合),似通过瓶颈一样的阻塞
作用而使各个mtdna子集合群体数量明显减少,只
有少数mtdna进行选择性复制,故一种突变基因型
可以占优势并固定出现在下一代中。
ashley等[41发现
该”瓶颈理论”结果与人类mtdna相似,即在单个个
体中异质性的大小可以改变,子代可以有不同的基因
型,仅仅两三代异质性就可以转为同质性。
共存的突变型和野生型mtdna通过减数分裂或
有丝分裂随机分布到子代细胞中,由此细胞中突变型
和野生型mtdna比例随之发生随机增减,也称遗传
渐变,最终,再分裂的子代细胞有向全部为突变型或
野生型mtdna。
即同质体的方向发展的趋势,该过程
称为“复制分离”。
随着复制分离和遗传渐变的发生,
一些mtdna中选择作用不明显的突变建立起同质
体.并以一定的频率保留于人群中.形成mtdna某些
区段的多态性。
然而,一些重度突变因复制分离造成
的同质体个体极易因自然选择而淘汰。
因而,多数重
度突变无法建立起同质体,表现为异质体,异质体在
人群中往往只能建立较低频度的多态性。
遗传瓶颈出现在卵细胞形成过程中的推测后来
得到了证实。
bendall等【5i研究了180对双胞胎,其中
发现4例有异质性。
采用遗传渐变理论模式推算,估
计减数分裂的代间瓶颈大约有2至,100个分子.对于
特定的母子间传递的mtdna估计有3~2o个分子
作者计算人mtdna—hvi的突变和固定的率在1.2x
1o~2.7×
10-5/每代、每位点之间,相当于1个转位
突变/2500年至1转位突变/55000年的范围。
调查结
果与其他文献报告基本相符,说明遗传瓶颈相对比较
狭窄,形成了一种制约因素。
调查结果也证实,不同的
母系间的瓶颈大小确有差异。
一个成年人体内mtdna估计有一兆,mtdna复
制聚合酶缺乏忠实性,受精后的细胞发育过程中出现
变异,形成组织间mtdna型别差异的可能性的确存
在。
有研究发现原胚层组织异质性是一致的,胎儿各
组织型别一致,但到了成人,不同组织的异质性分布
【作者简介】翟仙敦(1977一),女,山西临汾人,硕士研究生,助教,主要从事法医遗传学研究。
tel:
+86—027—83692645;
e—mail:
san—
mao506@163.corn。
法律与医学杂
志20XX年第l3卷(第2期)
出现差异。
tully等(1998)用dgge方法检测21名成
年人不同组织如血、骨、毛发、肝、肌肉,发现异质性出
现的程度有差异,有的容易检出有的不能检测。
研究
资料显示,在细胞分化、发育过程中,也可有mtdna
控制区碱基变异。
实验观察组织问异质性的发生存在
与卵细胞形成过程中类似的瓶颈,ciafaloni等发现同
一个体不同组织变异型与野生型mtdna出现率有差
异,证实了组织问存在异质性的分离。
例如某妇女,经
过多次提取口腔拭子和血样,检测出异质性,同个体
头发材料,5根是16355t,3根是16355c,2根是两种
型的混合物。
提示在细胞分化、发育过程中也可能存
在另一种瓶颈。
二、mtdna异质性的类型及好发位置
异质性按其存在形式分为点异质性和长度异质
性两类,它既可发生在代问也可发生于代内。
正常人
mtdna异质性高发于控制区,而编码区几乎没有。
[61
通常,异质性序列之间差异仅限于某一个碱基,称
为点异质性。
同时出现两个位置碱基序列不同的概率
虽小,但仍有报道:
而同时出现3个或者3个以上的
情况至今尚未见报道。
mtdna序列变异主要是复制过
程中碱基错配,其中转换占90%以上。
少数是颠换。
点
异质性主要集中于hvi和hvii。
hvi碱基转换类型
多发生在嘧啶之间,约为80%。
hvii的转换碱基中,
嘧啶与嘌呤约各占一半。
颠换多发生于c和a之间.
并几乎都集中在hvi。
人群中点异质性的发生率因检
测方法的灵敏度不同而差异很大。
hvi16189nt碱基
替换的发生率很高,其中t—c转换高达l5%。
长度异质性主要发生于hvi1618416193nt
和hvii303—315nt的c—stretch区,表现为c数目
的差异。
在序列测定时可观察到16189nt和310nt
后多个信号峰交叠形成的模糊序列,即“手指样结
构”。
[71根据anderson序列,c—stretch分别于16189nt
和310nt被t阻断,可能由于复制滑动引起的相同碱
基单调连续趋势,该区被认为是突变的热点而这一
趋势产生了长度异质性。
bendall等[8】也认为长度异质
性形成原因主要是dna复制滑动。
无关个体问
mtdna长度异质性差异较大,根据hvii303309
nt碱基c数目的多少,可分为单纯同质性(c7)、轻度
异质性(c8为主)、明显异质性(c8和c9为主)和t—c
转换后序列失控(c10一c14)4种。
hvi16189nt约
l5%的t—c转换中又有66%形成长度异质性。
[91与
hvi不同,hvii的t很少缺失。
由此认为hvii的长度
异质性机制是c在303—309nt区域内的插入和复制
滑动,形成3lontpc的转换。
同一母系中,与16189
·
l4l·
突变相关的长度异质性,分布和变化相对稳定,但无
关个体问差异很大。
bini等[1ol研究发现异质性长度c
的个数与c—stretch上游的a碱基数目呈负相关,相
对于c数目的不稳定性,同一个体a数目恒定,这一
发现对家系分析和法医学领域中包括单根毛发在内
的组织比较有较大意义。
一般而言,如果c—stetch区
的c多于8个,就会增加长度异质性的几率。
&
#8943;
1
通常.骨骼肌和神经组织的异质性水平相似,毛
发中相对较高.外周血的异质性最低。
[121
三、mtdna异质性检测方法
(一)测序
序列测定是检测mtdna多态性和异质性最常用
的方法。
尽管一直以来测序被认为是检测突变的金标
准,但若异质性水平低于20%该方法即很难检出,这
也是先前普遍认为异质性发生率很低的原因。
克隆后
测序又比pcr产物直接测序更可靠,因其可排除因
pcr过程中taqdna聚合酶滑脱造成的序列改变。
对hvii轻链测序发现,由于临近c—stretch区产生的
长度异质性使3lont的异质性比率达50%,这是一种
普通的人为假象,通过对重链的测序可消除该假象。
[131
因此为避免可能存在的影响,mtdna高变区序列测定
要求对重链和轻链进行双向测序,并至少重复一次。
(二)序列特异性寡核苷酸(aso)探针杂交
pcr—aso分析技术先用pcr扩增得到靶dna
片段,再用aso探针与目的dna扩增片段杂交.阳性
结果说明靶dna含有与探针相应的等位基因。
尽管
pcr—aso分析技术有操作简单、灵敏度高、特异性好
等优点,但目前所用特异性探针较少,系统的个人识
别能力有限是其局限性之一。
多重pcr特异性寡核苷
酸片段用于检测突变链,可以发现小于l%的异质性,
然而等位特异性扩增很容易受pcr初始熔链温度的
影响,易发生错误的扩增,且无法估计异质性的数量。
(三)限制性片段长度多态性(restriction哪ent
lengthpolymorphism,rflp)分析
在mtdna高变区,大约有2/3的碱基变异涉及限
制酶识别位点,故可用rflp检测点异质性。
与直接测
序相比,荧光rflp分析较低程度的异质性更灵敏一
些。
但应注意避免因不完全消化而导致错误的结论。
(四)单链构象多态性(singlestrandconformation
polymorphism,sscp)分析
pcr—sscp技术可灵敏地检测到单一碱基的突
变,且具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、无假阳
性等特点,适用于大样本dna突变的筛查。
但存在影
响因素较多、条件不易掌握及带型难以解释等问题。
142·
基于毛细管电泳技术发展起来的荧光sscp(f—sscp)
技术,其灵敏度非常高,特异性好,但技术要求及成本
均很高。
(五)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgel
electrophoresis,dgge)
dgge是基于待测dna片段双螺旋的解链温度
(tm)来进行突变检测的,它具有灵敏度高、分离片段
可回收测序、一次可检测大量样本等优势。
1999年,
steighner等㈣在评估pcr—dgge技术检测mtdna
hv1序列多态性的可靠性时。
所有设计的49对配对
序列(每对仅存在1bp差异)用该技术可全部有效加
以区分。
pcr—dgge技术检测异质性的灵敏度高达
l%,远远高于序列测定。
但该技术存在实验之初需进
行计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件、需使
用带gc—clamp的引物增加了实验费用、gc含量较高
的片段不易分析、制备精确的梯度凝胶需要熟练的操
作技巧及复杂的仪器设备、仅能检测突变的存在不能
确定突变的类型等不足
(六)变性高效液相色谱(denaturinghigh—performance
liquidchromatography,dhplc)技术
dhplc是一种可自动检测单碱基替代及小片段
核苷酸插入或缺失的一种高性价比分离技术.具有自
动化、快速、经济、检出率高、检出dna片段大小范围
广、既可分析已知突变也能筛查未知变异等优点.成
为目前分析已知或未知基因突变及单核苷酸多态性
的最佳技术平台。
目前只有f—sscp技术在敏感性和
特异性方面能与dhplc相媲美。
其不足是不能检测
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