实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx
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实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤
以下实验步骤仅供参考:
1样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。
混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:
100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40µgRNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:
A260×稀释倍数×40µg/ml。
具体计算如下:
RNA溶于40µlDEPC水中,取5ul,1:
100稀释至495µl的TE中,测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35µl,剩余RNA总量为:
35µl×0.84µg/µl=29.4µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25µl溶液。
胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。
5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
②反应体系如下:
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 阳性模板上游引物F 0.5μl
3 阳性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 阳性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系:
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 内参照上游引物F 0.5μl
3 内参照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待测样品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:
93℃ 2分钟,然后93℃1分钟,55℃2分钟,共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系:
序号 反应物 剂量
1 10×PCR缓冲液 2.5ul
2 MgCl2溶液 1.5ul
3 上游引物F 0.5ul
4 下游引物R 0.5ul
5 dNTP混合液 3ul
6 Taq聚合酶 1ul
7 cDNA 1ul
8 加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟);72ºC延伸5分钟。
②PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释:
将PCR产物进行10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
体系配置如下:
序号 反应物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为:
93℃2分钟预变性,然后按93℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:
PrimerPremier5.0,并遵循以下原则:
引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。
PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView™染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR
组织RNA提取:
一般认为100mg肝组织提取RNA500ng,100mg肺提取RNA200ng,脑内的RNA丰度适中,100mg脑组织,提取RNA5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C15min(反转录反应)
85°C5sec(反转录酶的失活反应)
RealTimePCR反应
选用脑源神经营养因子(BDNF)为目标基因,核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。
基因
引物序列
扩增片段长度
NR2B
NR2B(+)
CCGCAGCACTATTGAGAACA
213bp
NR2B(–)
ATCCATGTGTAGCCGTAGCC
18srRNA
18srRNA(+)
tttgttggttttcggaactga
198bp
18srRNA(–)
cgtttatggtcggaactacga
1)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。
试剂
使用量
终浓度
SYBR®PremixExTaqTM(2×)
12.5μl
1×
其他值得注意的条件:
1建议使用0.2-ml薄壁管。
厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。
2最佳反应体积为50ml,推荐用30ml矿物油覆盖(对盖子加热的PCR仪可以不加)。
3大多数反应中,0.75ml(0.5~1ml)的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。
4建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。
然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓度是必需的。
5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。
因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。
DNA片段长度可以超过50kb,传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。
6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。
请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。
7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。
进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为24~34个核苷酸,溶点在60~68℃间。
使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。
这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
8变性:
第一步变性在94℃下进行2分钟。
在循环过程中尽可能缩短变性时间(94℃下进行20--30秒),除非模板中富含GC,则95℃下变性30秒。
这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时,应该尽可能的降低变性温度。
9延伸:
68--72℃下进行延伸操作。
10循环延伸:
尽量采用循环延伸的条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸的时间,例如在扩增10kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。
11长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A,因此建议采用T/A克隆。
若要进行平端可隆,可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。
12测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一的(染色体)带型。
13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样:
1
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