蛋白质的十种提取方法Word格式.docx
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蛋白质的十种提取方法Word格式.docx
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3、用离心机离心8000rpm40min4?
或11100rpm20min4?
4、提取上清夜,样品制备完成。
蛋白质提取液:
300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳~
二、
植物组织蛋白质提取方法(summer)
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20?
的条件下过夜,然后离心(4?
8000rpm以上1小时)弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4?
8000rpm以上1小时),然后真空
干燥沉淀,备用。
4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15?
8000rpm以上1小
时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4?
待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80?
备用。
药品:
提取液:
含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液:
2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的
DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点~当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少~
三、
组织:
肠黏膜(newinbio)
目的:
WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:
(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温10min
离心:
12000g,10min,4度,弃上清
加入0.3M盐酸胍/95,乙醇:
(2ml每1mlTRIPURE用量)
振荡,置室温20min
7500g,5min,4度,弃上清
重复0.3M盐酸胍/95,乙醇步2次
沉淀中加入100,乙醇2ml
充分振荡混匀,置室温20min
7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
1,SDS溶解沉淀
10000g,10min,4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的问题:
加入1,SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶,测
浓度,含量才1mg/ml左右。
解决:
提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2XBUFFER,然后煮5,10分钟,效果很好的。
四、
lysissolution:
(yog)
Proteinextractionbuffer(Camiolobuffer):
100ml=(0.075MPotassiumAcetate)0.736g(0.3M)NaCl1.753g
(0.1M)L-argininebasicsalt1.742g(0.01M)EDTA-HCl0.292g
(0.25%)TritonX-100250.ul
upto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.
1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.
3.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.
4.Homogenizefor1minuteat4\'
C.5.Spinat3,000.rpm/15minutes/4\'
C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith
50mM/LTris-HClpH7.4.
五、
植物材料:
水稻苗,叶鞘,根(ynibcas)
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysisbuffer:
ureanp-40ampholine2-mepvp-40
六、
蛋白质样品制备(sigma)
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入
1.5ml10%三
氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20?
沉淀1小时,4?
,15000
r/min离心15
min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇),再于-20?
沉淀1小时,同
上离心弃上清,
(有必要再用80,丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二
硫苏糖醇),
2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc,pH3.5-10),6%TritonX-100],37?
温
育30min,期间搅
动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min,离心力
越大时间长一点
越好~上清即可上样电泳。
或者-70度保存
七、
植物根中蛋白质的抽取(phenol)
(1)sample,液氮研磨
(2)装1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4+K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上层液,蛋白质就在里面
八、
SDSextractionfollowedbyacetoneprecipitation–simpleextractionprotocolthatdoesnotrequirephenol.
Recommendedstartprotocolforwholetissueextractions.(hgp)
1.Grind1goffreshtissuetoapowderwithliquidnitrogeninamortarandpestle.
2.Add5mLofextractionmedia(0.175MTris-HCl,pH8.8,5%SDS,15%glycerol,0.3
MDTT)directlyto
mortarandcontinuegrindingforanadditional30sec.3.Filterhomogenatethroughtwolayersofmiraclothintoa50mLFalcontubeatroom
temperature.
4.Immediatelyadd4volumesoficecold100%acetonetofilteredhomogenate,mix
byvortexingandplaceat-20
Cforatleastonehourtoprecipitateproteins.5.Centrifugeat5000gfor15mintocollectprecipitatedprotein,decant
supernatant.
6.GentlyblotresidualacetonefromcontainerwithKimwipeandthenwashpelletin
15-20mLofcold80%
acetone.Besuretothoroughlybreak-uppelletbypipetting,vortexingorsonication.7.Repeatsteps5and6.
8.Collectfinalproteinprecipitatebycentrifugationat5000gfor15minanddrypelletbyinvertingonKimwipe
for15minat37C.
9.Resuspendfinalpelletin0.5-1mLofIEFextractionsolution(8Murea,2Mthiourea,2%CHAPS,2%Triton
X-100,50mMDTT,0.2%pH3-10ampholytes)bypipettingandvortexingat25-30C.Incubatesamplefor1hat
roomtemperaturewithagitation.Donotheatsampleunderanycircumstancesasthiswillleadtocarbamylationof
proteins.
10.Centrifugefor10minat12000gandusesupernatanttorehydrateIPGstrips.11.Ifproteinquantitationisnecessary,precipitateproteinsamplewithTCAoracetonepriortoperforming
BradfordorLowryassayasdetergentsandreducingagentsinterferewiththeseassays.Phenolextractionfollowedbymethanolicammoniumacetateprecipitation–an
effectiveprotocolforsample
preparationfromprotein-poor,recalcitranttissuessuchasplants(seeHurkmanand
Tanaka,1986,Plant
Physiology81:
802-80
九、
材料:
细菌蛋白(puc18)
用甲醇提取的,冻干后用缓冲液溶解的。
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- 蛋白质 提取 方法