临床基因扩增检验的质量控制与持续改进-刘晓春PPT文档格式.ppt
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n实验室测定:
实验室测定:
标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。
n报告和解释:
报告和解释:
结果发出、结果解释和临床管理。
标本采集的质量控制标本采集的质量控制1标本采集n标本采集时间对扩增检测结果的影响n标本采集部位的准备n标本的类型和采集量n采样质量的评价n采样及运输容器n标本采集中的防污染标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集时间对扩增检测结果的影响n在疾病发展过程中,标本采集过早在疾病发展过程中,标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。
或过晚都可能会给出假阴性结果。
标本采集部位的准备标本采集部位的准备n血液标本采集血液标本采集n分分泌泌物物标标本本:
采采集集部部位位的的清清洁洁消消毒毒可可去去掉掉污污染染的的微微生生物物或或其其它它杂杂物物,但但应应适适度度,过过度度清清洁洁消消毒毒有有可可能能会会去去掉掉或或破破坏坏靶靶微微生生物物,故故标标本本采采集集部部位位的的准准备备应应由由训训练练有素的人员进行。
有素的人员进行。
标本的类型和采集量标本的类型和采集量n标本的类型标本的类型:
血清血清(浆浆)、分泌物、痰、粪便、尿、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。
和脑脊液等。
n标本的采集量标本的采集量:
应根据所测病原体而定。
一般来说,应根据所测病原体而定。
一般来说,如果标本的量对病原体培养够用的话,则其量亦如果标本的量对病原体培养够用的话,则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。
足以用于核酸提取及其后的扩增检测。
n对于定量测定来说,对标本的收集要求更为精确。
对于定量测定来说,对标本的收集要求更为精确。
采样质量的评价采样质量的评价n血清血清(浆浆)标本标本:
溶血、脂血等;
n分泌物、痰:
评价内容包括细胞组成,所分泌物、痰:
评价内容包括细胞组成,所需类型细胞的数量和核酸总量。
需类型细胞的数量和核酸总量。
评价方法:
包括肉眼观察评价方法:
包括肉眼观察,显微镜下观察和显微镜下观察和化学分析等。
化学分析等。
采样及运输容器采样及运输容器n标本的采集材料如棉签应为一次性使用;
标本的采集材料如棉签应为一次性使用;
n采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置;
采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置;
n采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。
核酸扩增及检测过程造成干扰。
标本采集中的防污染n采集中要特别注意污染,防止混入操作者的头发、采集中要特别注意污染,防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等;
表皮细胞、痰液等;
n如使用玻璃器皿,必须经高压灭菌,以使可能存如使用玻璃器皿,必须经高压灭菌,以使可能存在的在的RNase失活。
失活。
标本运送n样本一经采集,则应尽可能快的送至检测实验室。
n样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。
n实验室应根据待测靶核酸的特性,对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。
标本保存n靶核酸靶核酸(尤其是尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅易受核酸酶的作用而迅速降解,因此标本的保存对于核酸扩增测定速降解,因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。
的有效性极为重要。
n使用使用GITC作为稳定剂保存标本,标本可在作为稳定剂保存标本,标本可在室温下稳定约室温下稳定约7天。
天。
标本保存n临床体液标本长期保存应在-70下。
n如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本,可于10mmol/LTris,1mmol/LEDTA(pH7.58.0)缓冲液中4下保存。
n用于RNA扩增分析的样本,则应于上述缓冲液中-80或液氮下保存。
n核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。
室内质量控制室内质量控制2医疗机构临床实验室管理办法医疗机构临床实验室管理办法第三章医疗机构临床实验室质量管理第二十五条医疗机构临床实验室应当对开展的临床检验项目进行室内质量控制,绘制质量控制图。
出现质量失控现象时,应当及时查找原因,采取纠正措施,并详细记录。
第二十六条医疗机构临床实验室室内质量控制主要包括质控品的选择,质控品的数量,质控频度,质控方法,失控的判断规则,失控时原因分析及处理措施,质控数据管理要求等。
第二十七条医疗机构临床实验室定量测定项目的室内质量控制标准按照临床实验室定量测定室内质量控制指南(GB/20032302-T-361)执行。
室内质量控制工作流程室内质量控制工作流程IQC操作选择质控物选择质控物绘制质控图绘制质控图确定质控限确定质控限记录数据记录数据选择规则选择规则管理数据管理数据室内质控的目的室内质控的目的1、检测、控制本实验测定工作的精密度精密度2、检测其准确度的改变准确度的改变3、提高常规测定工作的批间、批内标本批间、批内标本检测结果的一致性检测结果的一致性基本统计量基本统计量算术平均数方差方差n总体方差n样本方差n标准差n变异系数(CV):
nZ-Z-分数分数正态分布正态分布当分析一质控样本时,可获得可变化的值。
由于测当分析一质控样本时,可获得可变化的值。
由于测定的随机误差定的随机误差(所有测定过程的特征)(所有测定过程的特征)可导致结果的差异。
可导致结果的差异。
当用稳定的方法对质控样本检测得到足够的结果时,当用稳定的方法对质控样本检测得到足够的结果时,结果的分布接近正态分布。
一般来说,可假定质控样本结果的分布接近正态分布。
一般来说,可假定质控样本的值是正态分布。
的值是正态分布。
结果的分布因此可以用结果的分布因此可以用平均值平均值和和标准差标准差来描述。
来描述。
正态分布的特征正态分布的特征正态曲线下面积的分布规律正态曲线下面积的分布规律n1的面积占总面积的的面积占总面积的68.2%n2的面积占总面积的的面积占总面积的95.5%n3的面积占总面积的的面积占总面积的99.7%临床基因扩增检验的室内质量控制n测定前的质量控制n核酸样本的制备及其质量控制n统计学质量控制n质量控制的评价测定前质量控制测定前质量控制n实验室设施、仪器设备及管理实验室设施、仪器设备及管理n理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法n人员培训人员培训实验室设施、仪器设备及管理n临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备;
n实验室仪器设备应保养良好,实验用品要达到相应的要求。
加样器的校准?
带滤塞吸头的使用及质检?
离心机?
热循环仪?
水浴箱和/或恒温干浴仪?
酶标仪和洗板机?
基因扩增仪器设备的质控带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检n首先制备一个含12%甘油及色素(如甲基橙)的水溶液,如果吸头的最大体积为100l,则将加样器吸取体积调至110120l,再套上吸头后吸取上述有色液体。
如果吸头质量好,则有色液体不应出现在滤芯之上,否则说明滤芯不严。
n抑制物质检试验抑制物质检试验核酸提取用离心管质检核酸提取用离心管质检n离心管离心管PCRPCR抑制物质检抑制物质检n其他其他扩增仪孔间温度的重复性和均一性扩增仪孔间温度的重复性和均一性n一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统,当孔间温度变异超出1时,其可测出来。
n具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中,热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中,然后按程序进行一个常规的PCR扩增,加热模块如为96孔,则至少要测定12孔不同位置孔内的温度,在整个扩增过程中,可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度,但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。
扩增仪孔间温度的重复性和均一性扩增仪孔间温度的重复性和均一性n第二种方法并非直接测定孔内温度,而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性,即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测,观察结果的一致性程度,如果有某一个或几个孔结果有问题,则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果,如果是,则表明相应孔的热传导有损坏。
理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法n试剂盒的质检试剂盒的质检n定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等(例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等)的标准差人员培训人员培训n临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤,这其中所涉及的又主要是加样器的使用,尽管操作简单,但由于均为微量操作,要获得稳定可靠的测定结果,操作人员需要一定的专业技术知识和经验.n知其然又知其所以然知其然又知其所以然。
统计学质量控制统计学质量控制n理想的室内质控样本的条件n测定中质控样本的设置、数量及排列顺序n统计学质控的特点n统计质控方法理想的室内质控样本的条件理想的室内质控样本的条件n基质与待测样本一致;
n所含待测物浓度接近试验的决定性水平;
n稳定;
n靶值或预期结果已定;
n无已知的生物传染危险性;
n单批可大量获得;
n价廉质控物浓度的选择质控物浓度的选择n定量测定:
测定线性范围内的高、中、低三种浓度n定性测定:
接近方法测定下限的浓度n阴性质控物临床基因扩增检验临床基因扩增检验IQCIQC统计统计计算问题计算问题n可使用质控样本扩增后的IU/ml来进行统计计算,也可用其对数值进行。
n由于基因扩增结果的原始数据通常很大,可能不呈正态分布,故使用其对数值来进行质控统计分析。
每次(批)测定质控物的数量及放置n标本数量如小于30,弱阳性和阴性质控各1份,标本数量增加,质控物数量相应按比例增加n均匀分散于临床标本中,与临床标本一同处理(核酸提取)n扩增时的排列顺序,可排于标准品或校准品之后,临床样本之前。
但在扩增仪中的位置,不应永久性的固定的在一个孔,而应在每次扩增检测时,进行相应的顺延,以使在一定的时间内,可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。
阴性质控样本的种类n阴性原血清样本n实验过程中带入的空管n仅含扩增反应混合液的管阴性原血清样本的功能n监测实验室的以前扩增产物的“污染”n由实验操作所致的标本间的交叉污染。
具体地说,如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等n扩增反应试剂的污染。
核酸提取过程中带入的空管核酸提取过程中带入的空管n监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在(在整个实验过程中,开口放置于核酸提取的操作台面区域内,最后以水为基质,进行扩增)仅含扩增反应混合液的管仅含扩增反应混合液的管n监测试剂的“污染”实验室是否发生污染的鉴别实验室是否发生污染的鉴别n可将一个或多个空管打开静置于标本制备区3060分钟,然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增,如为阳性,而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性,则说明实验室以前扩增产物的存在。
质控规则的表达方式及定义质控规则的表达方式及定义n质控规则的表达方式n质控规则的功能n常用质控规则的符号及定义质控规则的表达方式质控规则的表达方式n通常质控规则以符号AL来表示,其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数,L为控制限,通常用均值或均值13SD来表示。
n当质控测定值超出控制限L时,即可将该批测定判为失控。
n常用的13S质控规则,其中1为原式中的A,3s为原式中的L,表示均值3s,其确切的含义为:
在质控测定值中,如果有一个测定值超出均值3s范围,即可将该批测定判为失控。
质控规则的功能
- 配套讲稿:
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- 特殊限制:
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- 关 键 词:
- 临床 基因 扩增 检验 质量 控制 持续 改进 刘晓春