第四章-胚胎分割技术PPT推荐.ppt
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内细胞团第一节概述二、胚胎分割技术的应用研究遗传、环境相互作用(一卵双犊)避免牛的异性孪生不育胚胎性别鉴定与胚胎移植相结合可提高胚胎移植本身的效率,扩大优秀品种的后代数量,提高性能,加快品种改良和畜群增殖。
分割胚的冷冻保存法如能过关,则半胚可随意推迟移植时间,生产出不同年龄的一卵双胎,以用于各种试验。
第一节概述三、胚胎分割技术研究概况胚胎分割技术开始于Nicholas(1942)对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。
其后,Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。
20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。
目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。
我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠,1987年又获得同卵双生山羊。
1986年窦忠英等获得分割胚牛犊,1990年又获得奶牛四分胚后代。
1987年谭丽玲等获得同卵双生牛犊。
第二节胚胎分割基本操作程序一、切割器具的准备二、胚胎预处理三、胚胎分割四、分割胚的培养五、分割胚胎的保存和移植第二节胚胎分割基本操作程序一、切割器具的准备体视显微镜、倒置显微镜、显微操作仪、胚胎固定管、切割针(玻璃针和微刀)胚胎切割的工具第二节胚胎分割基本操作程序二、胚胎预处理为了减少切割损伤,胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短期处理,使透明带软化并变薄或去除透明带。
第二节胚胎分割基本操作程序三、胚胎分割1、卵裂球分离培养法桑椹胚之前的胚胎将桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明带,分离每个卵裂球,将其包埋于琼脂中,将包有卵裂球的琼脂柱,移到中间受体小鼠或兔的输卵管中,经数日活体内培养后,再取出已发育到多细胞的胚胎,移于受体子宫。
二、胚胎分割方法毛细管吹吸法毛细管吹吸法2-到8-细胞期卵裂球(有的是16细胞,应在致密化之前)1.透明带切口或除去2.卵裂球二分3.半胚注入到空透明带中第二节胚胎分割基本操作程序2、桑椹胚或囊胚切割法
(1)致密化前各期胚胎的分割:
根据胚胎的直径,制作适宜口径的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管,在显微操作仪上,用固定吸管固定住胚胎,然后用微玻璃针自上而下切开透明带,使其成为一个切口,将微吸管自切口处伸入,吸住半数卵裂球,慢慢取出,这样即可把胚胎一分为二。
把吸出的半胚或卵裂球,纳入空透明带中,然后将分割后的胚胎包入琼脂柱,通过中间受体培养。
第二节胚胎分割基本操作程序2、桑椹胚或囊胚切割法
(2)桑椹胚至囊胚期胚胎的分割:
使用微玻璃针或微刀就可分割桑椹胚,无需固定吸管。
切割前需要对其进行透明带软化处理。
经软化处理的胚胎,与少量培养液一起置于载片上,把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方,然后自胚胎的等分线向下移动,把胚胎轻轻压住,继续下切,胚胎就被压扁,继而被切开,再把切割的胚胎纳入空透明带。
分割桑甚胚无方向性,而囊胚则必须沿着等分内细胞团的方向分割胚胎。
胚胎分割四、分割胚的培养为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率,分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。
早期胚胎切割后发育能力低,一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚,再从输卵管中回收胚胎,最后移植给受体。
琼脂二次包埋在含有20血清的培养液中平衡一段时间后,用直径0.3-0.5mm的细管移入加热融化(30-37)的1的琼脂中,吸出后在空气中停留数秒,稍微凝固(但仍是软的)后吹入培养液中,用27号注射器针头把琼脂条切短。
换用直径0.8-1.0mm细管移入加热融化的1.25的琼脂中,再包埋一次,形成1.5-2.0mm琼脂固体长条。
琼脂:
多孔,蓬松,不影响营养物质的吸收。
1.52.5mm0.8-1.0mm不采用体外培养的原因?
体外培养时囊胚的发育能力低。
胚胎的发育阻断。
分割胚自身发育能力低。
体内培养时可采用中间受体的生理基础:
受精过程有种属特异性但输卵管内的环境无种属特异性,不同物种的胚胎都可以培养。
移入假孕后或同期发情处理后的母畜的结扎的输卵管内,让其发育成囊胚。
从中间受体输卵管回收胚胎在中间受体输卵管中发育几天后,从结扎的输卵管中灌流回收胚胎。
用27号注射针去除包埋的琼脂。
图图12中中半胚重新形成囊胚腔半胚重新形成囊胚腔五、分割胚胎的保存和移植胚胎分割后可以直接移植给受体,也可以进行超低温冷冻保存。
为提高冷冻胚胎移植后的受胎率,分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段,再进行冷冻。
第三节胚胎分割的效果分析一、透明带对于分割胚体内外发育的作用二、种和品种差异对胚胎分割结果的影响三、胚胎不同发育时期分割胚或卵裂球的发育情况四、分割胚或卵裂球的发育五、影响分割胚胎发育的因素五、胚胎分割技术的应用11、胚细胞核移植、胚细胞核移植牛的单个卵裂球作为核供体克隆牛Le1998猕猴单个卵裂球进行卵母细胞带下注射,经体外培养和移植,生出一雌一雄Meng199722、构建异源重构胚胎构建异源重构胚胎外源内细胞团显微注射入受体囊胚腔(受体胚胎的内细胞团切割掉),即构成外源内细胞团和受体滋养层整合而成的异源重构胚,对异种妊娠具有重要价值。
33、研究遗传、研究遗传-环境相互作用环境相互作用对分割16-细胞期小鼠胚胎得到的同卵孪生后代的体重、头缘生长和背腹生长观察发现,孪生鼠之间体重的差别在出生后21100天可观察到。
头缘生长的差别比非孪生鼠小。
说明头缘生长更多地受基因控制。
Watanabe199844、生产嵌合体、生产嵌合体同种或异种胚胎的卵裂球分离后装入同一个透明带中;
将同种或异种动物的半胚融合在一起;
或将一枚胚胎的内细胞团注入另一胚胎的囊胚腔中,经体外培养后移植入受体种间妊娠中母-胎之间的相互作用、及妊娠过程中母体的免疫识别有重要意义55、产前诊断、产前诊断着床前胚胎的单个卵裂球或取出滋养层细胞的一部分进行生化检验、PCR扩增和性别鉴定以检测蛋白质或酶水平的生化缺陷、特定基因的缺失及伴性遗传病。
66、提高体外受精的妊娠率、提高体外受精的妊娠率牛为实验模型,将牛胚胎分割为半胚后,移植质量好的半胚,能将体外受精得到的胚胎的妊娠率由70%提高到110%。
也便于育种上的后裔测定。
生产同卵双胎或多胎,使可用胚数倍增,对于解决人类的不育问题无疑有着重要意义:
这增加的30%40%的机会将降低政府和病人的费用,同时降低妇女接受体外受精的压力、时间和复杂性。
思考题1、什么是胚胎分割?
该技术在实践中有何指导意义?
2、如何对早期胚胎进行分割处理?
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