实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法Word文档下载推荐.docx

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实验二油脂酸价的测定5

实验三蛋白质的提取及浓度测定？

（紫外吸收法）7

实验四淀粉酶活力的测定9

实验五酶的激活和抑制作用13

实验六氨基酸的分离鉴定一一纸层析法14

实验七基因组DNA的快速提取---碘化钾法16

实验八琼脂糖凝胶电泳技术一一DNA样品检测18

实验一还原糖和总糖的测定一一3,5-二硝基水杨酸比色法

、目的与要求

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的

3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

小麦面粉（1000g）

2•主要仪器

3.试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

100mg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转

移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL,混匀，4C冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：

称取6.5gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL

容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL,再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL

（3）碘-碘化钾溶液：

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：

称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6MHCI和6MNaOH各100mL。

（分别取59.19mL37%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL）

四、操作步骤

1.制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

管号

1mg/mL葡萄糖标准液

（mL）

蒸馏水

DNS（mL）

葡萄糖含量

（mg）

光密度值

（OD540nm）

2

1.5

1

0.2

1.8

0.4

1.6

3

0.6

1.4

4

0.8

1.2

5

1.0

6

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。

调波长540nm,用0号管调零点，测出1〜6号管的光

密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

葡萄糖标准曲线

葡萄糖含量（mg

2.样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

蒸馏水，搅匀，置于50C恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。

过滤，将滤液全部

收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（2）总糖的水解和提取

（以葡萄糖计）。

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相

应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量

还原糖（%=查曲线所得葡萄糖毫克数x测定液总体积积x

x0.9x100

样品毫克数100

3总糖（%=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数X稀释倍数

样品毫克数

、,、卜\、、八

六、注意

1.标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

2.面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题

1•在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCI处理？

而在其测定前，叉为何要用NaOH中和?

2标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？

比色时设0号管有什么意

义？

3.绘制标准曲线的目的是什么？

实验二油脂酸价的测定

一、目的与要求

初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；

了解测定油脂酸价的意义。

油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有

刺激性气味，使油脂产生酸价。

酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸

价或者是酸值来表示。

同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。

酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。

酸价越高，油脂的质量也越差。

三、主要仪器、实验材料和试剂

1.锥形瓶（250mL）3个。

2.量筒（50mL）1支。

3.碱式滴定管1支。

4.花生油、菜油、芝麻油等。

5.乙醇-乙醚混合液（1:

1,V/V）。

6.0.1%KOH（1克KOH溶于1000mL纯水中）。

四、操作步骤

1.准确称取1~2g油脂于250mL锥形瓶中。

2.在瓶内加入乙醇—乙醚混合液50mL,充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。

待油样完全溶解后，加入1%酚酞指示剂3〜5滴，立即用0.1%KOH标准溶液滴定至溶液成微

红色（放置30S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。

酸价=2（V2-V1）/W

V2:

滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数

V1:

滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数

W:

油样重（g）

注：

滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。

一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。

五、实验结果

油脂名称

起始刻度

终点刻度、、

体积（mL）

酸价

备注

空白对照

六、思考题

测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么?

实验三蛋白质的提取及浓度测定（紫外吸收法）

一、目的与要求

掌握蛋白质的提取方法；

学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；

熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。

二、实验原理

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙

酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大

吸收峰在280nm波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1•试验材料：

萌发3天的小麦种子

2.主要仪器

（1）紫外分光光度计，

（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管（5）研钵（6）

100mL容量瓶

3•试剂：

标准牛血清蛋白溶液：

准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度

为1mg/mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500mL）的溶液。

1•蛋白质（淀粉酶）的提取

称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏

水，研磨匀浆。

将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。

提取液在室温下

\/

放置提取15〜20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。

然后在3,000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。

2.标准曲线制作

按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。

以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长

处测定各管溶液的光密度值OD280nm。

以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲

线。

表1蛋白质标准曲线制作

标准蛋白质溶液（mL）

蒸馏水（mL）

蛋白质浓度（mg/mL）

OD280nm

0.5

3.5

0.125

3.0

0.25

2.5

0.375

2.0

0.50

0.625

7

0.75

8

4.0