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C)7)普通冰箱(--20。
C)
用于贮藏药品、材料等。
确保冰箱门关严防止冻伤
6)超净工作台:
用于植物组织培养、微生物接种。
⑴确保使用状态时紫外灯必须关闭
⑵保持清洁
⑶不要用酒精擦拭有机玻璃挡板
7)恒温培养箱:
用于液体培养基中对细菌的培养
使用前调好温度计转速
8)高速冷冻离心机(台式、立式)
用于DNARNA等提取过程中的高速冷冻离心
⑴使用前要预冷,调好温度转速等
⑵必须调平
⑶使用后要关电源,擦拭干净(离心机内部的水珠)
9)PCR仪:
用于基因扩增
⑴使用前设好程序
⑵使用后关闭电源
10)移液器:
(0.2—1000卩l)
用于微量液体的移取
⑴使用前必须看清楚量程,并在量程范围内使用。
⑵使用时要缓慢用力⑶切记避免有机溶剂腐蚀枪杆⑷使用后调至最大量程
11)微波炉:
用途:
融化琼脂糖凝胶,或琼脂粉注意事项:
⑴注意微波时间
⑵避免污染物污染
12)凝胶电泳装置:
用于核的电泳的检测注意事项:
⑴使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合,定拟使用的电压,电流等。
⑵使用时要戴PE手套,并注意不要产生大量的污染物。
13)UV投射仪及凝胶成像系统:
用于核算条带的观察及照相注意事项:
⑴不要造成EB污染⑵使用时要先开电源,再开紫外,关闭是相反。
⑶使用后将凝胶几时拿走放回收处,并使仪器内部保持清洁。
14)烘箱:
用于烘干器皿
⑴防止器皿水分过多,造成短路。
⑵塑料凳器皿切记不要高温烘烤⑶玻璃器皿等高温烘烤后,注意及时断电,千万不能过夜。
15)分子杂交炉:
用于Southern、Northern等分子杂交。
注意事项:
⑴正确设定杂交温度,时间等。
⑵防止同位素遗漏,污染。
16)恒温培养箱、培养室:
生物材料的培养注意事项:
⑴正确设定培养温度、湿度、光照时间等培养条件。
⑵防止培养箱,培养是污染。
⑶注意温度的调节。
17)制冰机:
制碎冰。
⑴使用时先接通水源。
⑵使用后要关闭水源。
18)蛋白质、核算分析仪:
测定核算及菌液的浓度。
⑴使用时要先预热。
⑵使用前要调零。
⑶要调好光源。
19)测序仪:
对核算进行测序。
防止污染、按程序操作。
20)基因枪:
用于转基因。
无菌操作,保持清洁。
使用时检查是否漏气。
21)其他:
恒温水浴锅、研钵研杵、液氮罐、电炉子、通风橱、涡旋器、同位素室及暗室。
4.常见的有害化学物质:
A.苯酚、氯仿、异戊醇。
B.溴化乙锭(EB。
C.十六烷基三甲基溴化铵(CTAB。
D.焦乙酸二乙脂(DEPC.
E.放射性元素32P、35S
5.安全规程:
1)熟悉所有有害物质的标识。
2)在不知道正确操作程序时不要使用实验室的药品及仪器。
3)不要认为扩大污染源,或随意丢弃污染垃圾。
4)如果不小心将有害物质弄到皮肤或衣服上,马上采取有效措施处理。
5)严禁在实验室吸烟、饮食、以免误事和吸入有害物质。
6)不要穿拖鞋进实验室。
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一:
实验目的:
掌握大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。
二:
实验原理:
感受态细胞是经物理化学方法增强获取DNA能力的细菌细胞,其原理是处于0。
C的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀呈球形,此时,细菌处于容易吸收外源DNA的状态。
三:
实验仪器及药品:
1.仪器:
制冰机、恒温摇床、天平、酸度计
2.材料:
大肠杆菌DH5x,10ml离心管,1.5ml离心管
3.试剂:
0.1mol/ICaCI2溶液,80%甘油,LB液体培养基(1L),pH7.0-7.3
胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCI10g。
四:
实验内容:
1.用划线法将大肠杆菌DHa接种于无抗性固体培养基上,与37。
C倒置培养1--2天。
2.从菌落上挑取一个单菌落接至3ml液体培养基中,37。
C振荡培养过夜。
3.取0.5ml菌液转到一个装有50mlLB液体培养基的锥形瓶中,37。
C振荡培养2--3h
4.将菌液转移至10ml离心管中,冰上放置10min。
5.4。
C离心10min(4000r/min)回收细胞。
6.倒出上清液,将管倒置1min,以便培养液洗尽。
7.用冰冷的2ml0.1mol/lCaCl2溶液悬浮细胞沉淀,立即放在冰上保温30min.
8.4。
C离心10min(4000r/min)回收细胞。
(其上清)
9.用冰冷的0.1mol/lCaCl20.4ml悬浮细胞(务必放在冰上)
10.分装细胞:
200卩l/份,加30卩l无菌甘油,混匀置-80°
C冰箱中保存,此细胞即为感受态细胞。
思考题:
1.感受态细胞制备过程中的注意事项?
整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪
头等最好是新的,并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
2.Ca2+感受态细胞中的作用?
促进大肠杆菌转化。
实验二质粒DNA转化大肠杆菌
实验目的:
掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程,其原
理是细菌处于0°
CCaC2低渗溶液中,细菌细胞膨胀呈球形,转化混合物的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物贴附于表面,经42。
C短时间热击,促进细胞吸收DNA复合物,将细菌放置在培养基中保温—段时间,促使在转化过程中获得新表型得到表达,然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培
实验仪器:
超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温箱、-70°
C冰箱、水浴锅
实验材料:
大肠杆菌DHa,PUCIg质粒,离心管
实验试剂:
LB固体培养基20mg/mlX--gal40卩I200mg/mlPTG40卩I
实验内容:
1.取200卩1新配的感受态细胞加入DNA2卩I混匀,冰浴30min,同时用PUC1g故两个对照:
受体对照:
200卩l感受态细胞+2卩l无菌水
质粒对照:
200卩l感受态细胞0.1MCaC2溶液+2卩l质粒DNA
2.将管放在42。
C冰浴中90s。
3.冰浴2min。
4.每管加800卩l液体培养基,培养45min
5.加4卩lIPTG和40卩IX--gal混匀。
6.将混合液移至含有Amp(50mg/ml)的培养皿中,再用无菌涂布棒将菌液均匀涂满平板。
7.将适当体积(100卩l)转化的感受态细胞涂在备好的培养基上。
8.倒置平皿37。
C培养12--16h,出现菌落
实验结果:
含抗生素
不含抗生素
结果分析
受体对照组
DNA对照组
转化实验组
转化数:
=菌落数*稀释倍数*转化反应原液体积/涂菌板体积思考题:
如何提高转化率?
1)载体DNA及重组DNA2)受体细胞3)转化操作
4)试剂纯度与器皿的洁净度
实验三大肠杆菌质粒DNA勺提取
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA在拓扑学上的差异来
分离它们,在pH值介于12.0--12.5这个窄小的范围,线性的DNA双螺旋结构解开而被断裂,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的
氢键会被断裂,但现在两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密的结合在一起,当加入pH4.8的乙酸甲高盐缓冲液回复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA两条互补链仍保持在一起,因此,复兴迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会迅速而准确,它们缠绕成网状结构,通过离心,是染色体DNA与不稳定的
大分子RNAPr--SDS复合物等一起沉淀下来被除去。
仪器材料与试剂:
(一):
仪器:
恒温摇床等。
(二):
材料:
葡萄糖,Tris、EDTASDS等
(三):
试剂:
1.溶液I:
50mmol/l葡萄糖、25mmol/l三羟基氨基甲烷TrisHCL
10mmol/l乙二胺四乙酸EDTA
(去除细胞壁,保护DNA)
2.溶液ll:
0.4mol/INaOH(10ml)2%SDS(10ml)用前等体积混合
(破坏细胞膜,使DNA变性)
3.溶液III:
5mol/l乙酸甲(60ml)冰乙酸(11.5ml)水(28.5ml)
(使溶液恢复中性,使质粒DNA复性)
4.TE缓冲液(10ml):
10mmol/ITrisHCL1mmol/IEDTAddH2O灭)
5.70%乙醇,放-20°
C冰箱中用后即放回。
6.胰RNA酶。
7.凝胶加样缓冲液:
40淞糖,0.25%溴酚蓝。
8.氯仿/异戊醇按24:
1的体积进行配制。
实验步骤:
1.将2卩l含相应抗生素(50卩g/ml)的LB培养基加入到试管中,接入上述含质粒的大肠杆菌,37。
C振荡培养液。
2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中4000r/min离心2min。
3.吸取培养液使细胞沉淀,尽可能干燥。
4.细胞沉淀悬浮于100卩l溶液I中,充分混匀,室温放置10min。
5.加200卩l溶液II盖紧管盖,混匀内容物,将离心管放在冰上5min。
6.加入150卩l溶液III(冰上预冷),盖紧管盖,颠倒数次,是指混匀,冰上放置15min。
7.12000r/min离心5min,将上清液转移至另一离心管中。
8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇。
反复混匀,12000r/min离心
5min,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上吸干液体。
9.向上请中加入2倍体积无水乙醇,混匀后,-20。
C放置15--20min,
12000r/min离心5min,倒上清液,把离心管倒放在吸水纸上吸干
液体。
10.用1ml70%L醇洗涤质粒DNA沉淀振荡并离心倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。
11.加入20卩lTE缓冲液,其中含有20卩g/ml的胰蛋白酶时DNA完全溶解-20。
C保存。
操作要点:
1.溶液II必须新鲜配制,最好使用一次,将剩余的液体弃掉。
2.加入溶液III时,要把液体充分混匀,并在冰上孵育足够的时间,
使沉淀完全,如果为充分将细菌裂解物与溶液II混匀,将会影响
质粒DNA纯度。
大肠杆菌质粒D
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