各种微生物生化试验方法原理docWord文档下载推荐.docx

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大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。

2、蛋白质及氨基酸的分解产物

（1）硫化氢试验（hydrogensulfidetest）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。

本试验常用于区别肠道杆菌的种类。

沙门氏菌属通常为阳性;

大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。

（2）明胶液化试验（gelatinliguefactiontest）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。

变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；

大肠杆菌、沙门氏菌则不能。

（3）吲哚试验（indoletest）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，

为吲哚试验阳性。

大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；

产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。

吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚

细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段：

其中吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验（V）和枸橼酸盐利用试验（C），简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。

典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。

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实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术

如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是"

时间就是生命"

。

近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了突破性进展，许多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。

一、微量多项试验鉴定系统

该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。

这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。

它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.1ml）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。

试验时加入待检测的某一种菌液，培养2~48小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表（根据数码分类鉴定的原理编制成），得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。

微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。

国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；

上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；

中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；

深圳华士达生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。

国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；

瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；

美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：

日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。

微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异较大，有的价格贵，有的个别反应不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。

API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。

该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。

图1API20E鉴定卡示意图

鉴定未知细菌的主要过程：

将菌液加入每一个分隔室；

培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表（表1），判定各项反应是阳性还是阴性反应；

按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记"

＋"

，则写下其所定的数值，反应阴性者记"

－"

，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；

用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。

表1 

API20E反应判定表

鉴定卡上的反应项目

反应结果

代号

项目名称

阴性

阳性

ONPN

β-半乳糖苷酶

无色

黄

ADH

精氨酸水解

黄绿

红，橘红

LDC

赖氨酸脱羧

ODC

鸟氨酸脱羧

CIT

枸椽酸盐利用

绿蓝

H2S

产H2S

黑色沉淀

URE

尿素酶

红紫

TDA

色胺酸脱氨酶

IND

吲哚形成

红

VP

V.P.试验

GEL

蛋白酶

黑粒

黑液

GLU

葡萄糖产酸

蓝

MAN

甘露醇产酸

INO

肌醇产酸

SOR

山梨醇产酸

RHA

鼠李糖产酸

SAC

蔗糖产酸

MEL

密二糖产酸

AMY

淀粉产酸

黄绿

ARA

阿拉伯糖产酸

表2API20E举例说明

项目名称

ONPG

所定数值

1

2

4

试验结果

+

-

记下数值

编 

码

5

3

7

检索结果

5305773产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）

实验五、抗微生物药物敏感性试验

一、实验目的

抗微生物药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。

对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。

纸片扩散法

二、实验原理

此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏试验方法。

将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。

药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。

其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。

抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

三、实验器材和试剂

1．菌种 

金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床分离的菌株。

2．培养基 

MH（Mueller-Hintion）琼脂。

3．试剂 

无菌生理盐水，0.5麦氏标准比浊管（McFarland

standard，相当于1.5×

108CFU/ml），抗菌药物纸片：

选用直径6.35mm吸水量20μl的专用药敏纸片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨苄西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、头孢唑啉（FZN）、头孢呋辛（FRX）、头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、复方新诺明（SXT）。

4．其他 

无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。

四、方法步骤

1．菌液制备

（1）对数生长法：

从琼脂平板上选取至少3-5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35℃孵育2-6h。

用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。

（2）直接菌落法：

从孵育18-24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。

2．接种 

细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。

用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。

3．贴药敏纸片 

涂布后的平板在室温下干燥3-5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。

各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。

4．孵育

将平板倒置放入35℃孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中），16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。

五、结果判断

抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报