特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响Word格式文档下载.docx
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关键词………………………………………………………………………….……..1
第一章研究背景………………………………………………………….…………2
1.1实验材料及设备……………………………………………….………………….3
第二章研究方法及步骤
2.1Hela细胞的培养…………………………………………………………...……4
2.2RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达…………………….……5
2.3分离外周血单个核细胞(PBMC)……………………………………………6
2.4流式细胞技术检测T细胞活化相关CD分子………………………………….6
2.5ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-γ释放水平………………7
第三章研究结果
3.1RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达…………………….…….8
3.2PBMC对Hela细胞杀伤作用的形态学观察…………………………………..8
3.3流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子………………………………..…..9
3.4ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-γ释放水平………………9
第四章
讨论……………………………………………………………………………………9
第五章
结论…………………………………………………………………………………..11
参考文献……………………………………………………………..………………11
摘要
目的:
研究SonicHedgehog分子及其活化信号对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响。
方法:
RT-PCR检测Hela细胞SHH信号水平。
在Hela与PBMC共培养体系中添加SHH抗体来阻断SHH信号,形态学观察T细胞对Hela细胞的杀伤,流式细胞术检测T细胞活化,ELISA检测T细胞功能性细胞因子IFN-γ和IL-10释放水平。
结果:
SHH抗体可以促进T细胞分泌功能性细胞因子IFN-γ,但抑制免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌,增强T细胞杀伤宫颈癌细胞的效果。
结论:
特异性阻断SHH信号通路可以增强T细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用。
【关键词】:
SHH;
宫颈癌;
T细胞
Abstract
Objective:
TostudytheSonicHedgehogsignalingmoleculeandactivationofTcellsinperipheralbloodofanti-cancercellfunction.Methods:
RT-PCRdetectionofHelacellsinSHHsignallevels.PBMCwereculturedintheHelasystemwithaddedSHHSHHantibodytoblockthesignal,Tcellsmorphologyofanti-Helacells,Tcellactivationbyflowcytometry,ELISAdetectionoffunctionalTcellcytokineIFN-γandIL-10releaselevel.Results:
SHHantibodiescanpromoteTcellsecretionofcytokinesIFN-γ,butthesuppressionoftheimmunesuppressivecytokineIL-10secretion,enhancedTcellkillingeffectsofcervicalcancercells.Conclusion:
ThespecificblockingSHHsignalingpathwaycanenhanceTcellkillingeffectoncervicalcancercells.
[Keywords]SonicHedgehog,cervicalcancer,Tcell
研究背景
肿瘤是一种常见的疾病,是机体在各种致瘤因素作用下,细胞异常增生而形成的新生物,肿瘤细胞具有异常的形态,代谢和功能。
由于它的快速而无规律生长,不但消耗人体大量营养,而且破坏了正常器官的组织结构和功能目前肿瘤已经成为一列严重威害人类身体健康的常见病和多发病,现在全世界每年死于癌症的约有500万人。
随着免疫学的发展和人们生活水平的提高,肿瘤越来越受到人们的重视,近来关于Hh信号通路与肿瘤发生的关系也引起注意,研究发现多种肿瘤中存在着Shh信号通路的异常激活,而宫颈癌细胞就是其中之一。
子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。
在全球范围内,每年约有20多万女性死于宫颈癌。
全球发病率最高的是南非,其次在亚洲,我国发病率每年新增发病数超过13万,占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73-93%,排行榜首。
在发达国家,其发生率明显下降,在很大程度上归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗。
在发展中国家,由于宫颈筛查工作不完善,女性对宫颈疾病的忽视,致使我国宫颈癌的发生率是发达国家的6倍。
Hedgehog(Hh)基因,因为最初是从突变的果蝇体内发现,果蝇胚胎腹侧面布满尖状突起形似刺猬因而将其命名为Hedgehogt[1]。
1993年Forbes[2]等通过果蝇基因分析,首先提出Hedgehog信号通路(Hedgehogsignalling,Hh信号通路)的概念,以后Chen等[3]较为系统地阐述了Hh信号通路的基本组成及转导过程。
在脊椎动物中,Hedgehog基因家族共包括三个成员:
Indianhedgehog(Ihh),Deserthedgehog(Dhh)和Sonichedgehog(Shh),其中关于Shh基因的研究最多。
因此Sonichedgehog信号通路(简称Shh信号通路)的研究也相对更为深入。
Shh信号通路对靶细胞的作用是通过细胞膜上Patched(PTC)和Smoothened(SMO)两个转录元件所介导。
PTC是一种12跨膜蛋白,可和SHH蛋白结合。
SMO是7跨膜蛋白为信号转导子。
当SHH蛋白和PTC蛋白结合时,则PTC对SMO抑制解除,通过胞质微管上附着的Hedgehog信号复合物(Hedgehogsignalingcomplex,HSC)介导,使一种转录因子进入胞核,从而激活其下游基因的表达,该转录因子在脊椎动物中称为GLI,即在果蝇中被称为的ci。
当SHH尚未与PTC结合时,PTC可以抑制SMO,使之转变成同一基因的转录抑制子,抑制其下游基因的表达。
GLI共有3型即GLI1、GLI2和GLI3,每一种都有独特的转录功能,引起不同下游靶基因的激活或抑制。
对果蝇的研究表明.不同浓度的Hh基因表达的分泌蛋白HH可以引起靶细胞中不同形式的Ci进入其细胞核,从而引起不同的下游基因的表达[4]。
脊椎动物的研究也表明,Shh信号通路对靶细胞命运的决定同样与SHH蛋白表达的强度密切相关.即不同浓度SHH表达可以引起其邻近靶细胞产生不同形式的GLI进入胞核,进而引起不同基因的表达[5],参与维持肿瘤细胞的多种恶性生物学行为。
虽然机体的免疫系统能够产生肿瘤免疫应答,但是大多数肿瘤仍然能在体内进行生长,肿瘤细胞能通过自身的机制抑制免疫应答对自身的杀伤。
随着SonicHedgehog信号通路的异常激活在越来越多的肿瘤中发现,人们对这个信号通路产生了浓厚的兴趣。
现在人们不但发现SHH信号通路可以促进肿瘤细胞的增殖,而且人们还发现SHH信号通路也可以抑制T细胞的活化以及活化后的增殖,在已有国外实验发现了SHH分子及其活化信号在参与抑制T细胞活化和发育方面具有一定的作用,这可能是肿瘤自我保护,逃逸体内免疫应答的重要机制之一。
本研究通过阻断SHH信号后研究T细胞的活化及功能,探讨SHH信号对T细胞杀伤宫颈癌细胞株Hela的影响,为子宫癌防治提供新的思路,有助于提高子宫颈癌治疗的效果,并推动肿瘤免疫的理论发展。
1.1实验材料及设备:
1.1.1细胞
1.1.1.1肿瘤细胞
1.1.1.2PBMC细胞
1.1.2主要化学试剂:
胰蛋白酶粉末广州威佳科技有限公司
RPMI-1640干粉(10.4g/包)Sigma公司
碳酸氢钠广州化学试剂厂
胎牛血清杭州四季青生物工程公司
氯化钠台山化工厂
氯化钾广州化学试剂厂
磷酸氢二钠广东汕头达濠精细化学品公司
磷酸二氢钾汕头市化学试剂厂
SHH抗体SantaCruz
ELISA试剂盒达科为生物技术有限公司
1.1.3主要仪器设备:
单人双面净化工作台SW-CJ-1F型苏州净化单人双面净化工作台
离心机上海安亭科学仪器厂TDL-5Max:
5000rpm
4℃冰箱Haier公司BCD-256KF
超纯水仪PallCorporation公司Model:
CascadaLS
Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统上海天能科技有限公司
202A-2型数显电热恒温干燥箱上海浦东荣丰科学仪器有限公司
SCIENTZSB5200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司
二氧化碳细胞培养箱Heraeus公司HERAcell150
手提式压力蒸汽灭菌器YX-280合肥华泰医疗设备有限公司
流式细胞仪美国BeckmanCoulter公司
倒置荧光显微镜奥林巴斯
BP110S电子天平Sartorius公司Max:
110gd=0.1g
JYT-2架盘药物天平马头牌
微量移液器PipetmanGilson公司
2研究方法及步骤
2.1Hela细胞的培养
2.1.1细胞培养用具的准备
1)浸泡:
将细胞培养瓶、移液管、10、50ml离心管、试剂瓶、血清瓶、安培瓶等实验用具用清水冲洗干净,浸泡于洗衣粉水中,浸泡过夜。
2)刷洗:
用试管刷沾洗衣粉反复刷洗,反复冲洗干净后放入电热恒温干燥箱中烘干。
3)浸酸:
将烘干的器皿放入酸缸中浸泡过夜,玻璃用具浸泡于硫酸缸中(配方:
重洛酸钾63g,浓硫酸1000ml,蒸馏水200ml),塑料用具浸泡于盐酸缸中(5%盐酸)。
4)冲洗:
用具浸酸后用清水冲洗15次以上,再用单蒸水冲洗3次,再用双蒸水冲洗3次,必要时放入超声波清洗机中清洗,再放入电热恒温干燥箱中烘干。
5)高压:
将烘干的实验用具用锡纸包好,再用报纸包好,大、中、小枪头直接用枪头盒装好用报纸包好,置高温高压灭菌箱中高压灭菌,再放入电热恒温干燥箱中烘干。
2.1.2细胞复苏(Hela细胞)
从-120℃液氮罐中取出冻存的Hela细胞,迅速放到37℃水浴锅中,使细胞溶解,用酒精灯轻烧冻存管口,打开管盖,用吸管吹散细胞后,吸出细胞悬液到离心管中,加入2~3ml1640培养液,混匀后离心1000rpm,10min;
弃去上清液,加入5ml新鲜培养液(含10%血清),并用吸管轻轻吹打悬浮细胞,将细胞悬液移到细胞培养瓶中,37℃培养。
2.1.3细胞传代
取生长良好的Hela细胞,在超净台中倒去旧培养液,加入2mlPBS,轻轻振荡漂洗细胞,以去除细胞碎片,弃去
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