浅论EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在HuhWord格式文档下载.docx
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小干扰RNA;
肝细胞癌
Abstract:
Objective:
ToobservetheinhibitioneffectofShRNAonEphrinA1expressioninhepatomacelllineHuh-7throughconstructionoftheexpressedcarrier ofEphrinAI.Methods:
TwopairsofSiRNAweredesignedandsynthesizedaccordingtotheEphrinA1mRNAsequenceinGenBank,andthenwereinsertedinto plasmidstocreaterecombinantplasmids and (control).AfterbeingtransfectedintoHuh-7cells,EphrinA1expressedbyShRNAswasdetectedtobedownregulatedbyRT-PCR.Results:
Allplasmidswereconstructedsuccessfully.ExpressionofEphrinA1inHuh-7cellsinfectedwith plasmidswassignificantlydownregulatedcomparedwiththatisinfectedwith plasmids(P<).Conclusion:
Con-structionof laysanimportantexperimentalfoundationforgenetherapyofhepatocellularcarcinoma(HCC)bytargetingtheEphrinA1gene.
Keywords:
EphrinA1;
SiRNA;
HCC
受体酪氨酸激酶已经被公认为血管生成的重要信号分子,Ephrin配体及其受体Eph是其中最大的一个亚家族,其在肿瘤血管生成中的作用受到越来越多的关注[1]。
近期有日本学者用cDNA微列阵分析显示EphrinA1在AFP相关的肝细胞癌中是最多过度表达的基因。
我们的前期研究也表明,在人肝癌组织切片中EphrinA1蛋白的表达明显增高并与其血管生成明显相关;
EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关。
本实验拟构建靶向EphrinA1基因的RNA干扰重组体,通过沉默Huh-7肝癌细胞中EphrinA1基因的表达,以期为下一步探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用提供有力支持。
1材料和方法
材料
Huh-7肝癌细胞株由湖南湘雅中心实验室提供;
质粒购自美国Ambion公司;
T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司;
脂质体Lipofectamine
2000购自美国Invitrogen公司;
质粒提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应试剂盒购自TaKaRa公司;
RT-PCR引物由上海生工合成。
EphrinA1-siRNA转录模板的发夹结构设计
将EphrinA1的mRNA全序列输入到SiRNASepuenceSelector中,筛选出一个19nt的靶序列,阴性对照将SiRNA片段顺序打乱。
SiRNA靶序列为5’-ACCACAGGCAT
AAGCTATC-3’,ScrambleSiRNA靶序列为5’-CACACCATAATAAGGGTCC-3’。
然后用SiRNAHairpinOligonucleotideSequenceDesigner软件设计成能与载体相连接的双链发夹结构。
序列结构为BamHI+sense+loop+antisense+终止信号+SalI+HindIII。
实验组DNA模板序列为:
5’-ACCACACCACAGGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCCTGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’
3’-TGGTGTGGTGTCCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGACACCAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’
阴性对照组DNA模板序列为:
5’-ACCACACCACGAGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCTCGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’
3’-TGGTGTGGTCTGCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGCCACAAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’
交由上海博亚公司合成。
插入片段的退火和连接
将合成的寡核苷酸链溶解在ddH2O中,各取1μL正义和反义寡核苷酸链溶液,再加入48μL退火缓冲液,充分混匀,配制成50μL溶液,在PCR仪上95℃孵育4min,70℃孵育10min,缓慢冷却至4℃;
以HindIII,BamHI双酶切质粒,使载体线性化,取退火后的插入片段溶液1μL+线性化质粒5μL+T4连接酶2μL+T4连接酶缓冲液2μL在4℃下过夜。
分别命名为和。
重组质粒转化宿主菌以及质粒的提取和鉴定
以常规方法制备并转染感受态宿主菌DH5α,质粒的提取则按产品说明书进行,最后提取的质粒DNA,经SalI和EcoRI双酶切鉴定。
质粒转染
采用Lipofectamine2000脂质体介导的转染法。
在转染前一天,换液后调整Huh-7细胞密度为2×
105/mL,以每孔2mL接种于6孔板,待细胞增至80%融合时,将质粒、脂质体按体积比1:
6混合后转染至细胞中,操作按照说明书进行。
细胞内总RNA的提取及RT-PCR
采用Trizol一步法提取总RNA;
逆转录得到cDNA后行PCR反应;
EphrinA1:
正义5’-AACAAGCTGTGCAGGCATGG-3’,反义5’-CTCCACAGATGAGGTCTTGC-3’,产物230bp;
GAPDH引物:
正义5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’,反义5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’;
扩增条件:
95℃预变性5min,94℃变性50s,49℃退火45s,72℃延伸50s,28个循环,72℃延伸10min,4℃降温。
结果观察PCR产物经2%琼脂凝胶电泳,EB染色检测,用凝胶成像分析系统对DNA条带扫描,并分析结果。
统计学处理方法
采用方差分析。
2结果
和质粒酶切鉴定
根据载体的限制性内切酶图谱,质粒载体中无SalI的酶切位点,而在我们的插入序列里面加入了SalI的酶切位点,其酶切点在793bp位置,质粒本身在397bp处有单一的EcoRI位点,双链寡核苷酸片段则插在BamHI和HindIII中间,因此和重组质粒均可用EcoRI和SalI双酶切进行鉴定。
两重组质粒双酶切后均可切出大小为456bp的DNA片段,电泳结果与预期结果一致。
重组质粒的沉默效应
RT-PCR结果显示:
转染48h后组的EphrinA1mRNA表达水平较组和空白对照组明显下调,三者的灰度比值分别为±
、±
和±
,前者的灰度比值与后二者相比均明显降低,其差异均有显着性,而后二者灰度比值差异无显着性。
3讨论
RNA干扰现象,是由双链RNA介导的,在转录后水平关闭相应的基因序列表达的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默。
它由Fire于1998年在秀丽隐杆线虫的研究中首先发现并报道。
用RNAi技术可以高效、特异、快速地抑制细胞内癌基因的表达,使癌症表型逆转或病程得以控制。
和其他基因干预技术相比,RNAi具有两个明显的特征:
抑制基因表达的高效性和高度的基因序列特异性——这为我们进行人肿瘤细胞的RNAi抑制特异基因表达的研究提供了理论基础。
血管生成是实体瘤生长的基础,又是转移的重要途径。
肝细胞癌为典型的多血管型肿瘤,故抗血管生成治疗具有重要意义。
Eph/Ephrin是新近发现的受体酪氨酸激酶家族成员,其在肿瘤血管生成中的作用已经受到广泛的关注。
研究证实EphrinA1可通过与其受体结合,激活下游的信号传导通路,从而调控内皮细胞的激活、黏附、转移以及渗透,最终影响如乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤的血管生成。
同时针对Eph/Ephrin系统的抗肿瘤及抗血管生成基因治疗均显示出巨大的潜力[10]。
我们的前期研究表明在人肝癌组织切片中EphrinA1的表达明显增高并与其血管生成明显相关;
在本实验中我们成功地构建了针对EphrinA1基因的RNAi序列,并克隆至载体中,下一步我们将进一步检测EphrinA1基因沉默后对人肝癌细胞Huh-7生物学行为的影响,以探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用,以期能为临床上肝细胞癌的治疗提供新的靶点。
【参考文献】
[1]GaleNW,YancopoulosGD.Growthfactorsactingviaen-dothelialcell-specificreceptortyrosinekinases:
VEGFs,angiopoietins,andephrinsinvasculardevelopment[J].GenesDev,1999,13(9):
1055-1066.
IidaH,HondaM,KawaiHF,etal.Ephrin-A1expressioncontributestothemalignantcharacteristicsofa-fetopro-teinproducinghepatocellularcarcinoma[J].GUT,2005,53(6):
843-851.
陈钢,王怡,易继林,等.肝细胞癌中Ephrin-A1及其受体的表达与血管生成的关系[J].中国普通外科杂志,2007,16(8):
778-782.
FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):
806-811.
ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedma
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