外敷中药复方对促进骨折愈合的体外研究Word格式文档下载.docx
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根据中医骨伤的组方原则,本研究从抗炎镇痛,活血化瘀和接骨续筋三类中药中各选出两味最常用的中药,采用均匀设计法将六位中药按照不同剂量配比,组成五条方剂。
选择炎症因子(NO)释放、人体静脉上皮细胞(HUVEC-12)和成骨细胞(UMR-106)增殖试验分别反映抗炎镇痛,活血化瘀和接骨续筋的功效,测试各方剂对骨折愈合的影响。
结果表明,五组复方体外试验均表现出单重或多重促进骨折愈合的作用。
其中五号复方(大黄30克,栀子,三七,红花各9克,接骨木30克,续断15克)显示出全面的抑制NO释放,促进HUVEC-12和UMR-106增殖的活性。
研究结果证明了中药复方能从多个方面加速骨折愈合,其主效应包括抗炎镇痛,促进骨折局部的血液循环和新骨再生。
研究提供了以大黄、栀子为解毒君药,以三七、红花活血化瘀作臣药,续断、接骨木为佐使的基本外敷复方,实际应用时可根据辩证观察作适当增减,达到最佳疗效。
关键词:
骨折愈合,中药复方,均匀设计,细胞试验
CreatingaHerbalFormulaforTopicalTreatmentofBoneFractures
Abstract:
Fracturehealingisaprocessthatinvolvestheproliferationanddifferentiationofcellsandtissuesandcanbestimulatedbydrugs.Traditionalmedicinehasareputationinthetherapyonbonefracture.Itisbelievedthatherbalformulaepromotesbonerepairthroughmultiplefunctionsof“anti-inflammation”,“promotingbloodcirculation”and“stimulatingboneformation”.ThisstudyaimstoengineeraherbalformulaundertheguidanceofChinesemedicinetheories,thendefinetheeffectivedosageratiobetweentheherbsanddemonstratethebiologicaleffectsoftheformulaeondifferentparametersofhealingusingrelevantinvitroassays.Sixherbswhicharefrequentlyusedforfractureswerecombinedintofiveformulaeaccordingtothe“UniformDesign”method.Assaysofnitricoxide(NO)inhibitioninmousemacrophages,humanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)andratosteoblastsproliferationwereusedtoreflectthe“anti-inflammationinflammatory”,“circulationpromotion”and“boneformationstimulation”functions.TheresultsshowedthatalltheformulaeexpressedsignificantactivitiesofNOinhibition,andHUVECcellandosteoblastsproliferation.Formula5withthelargestdoses(containing30gRadixetRhizomaRhei,9gFructusGardeniae,9gRadixetRhizomaNotoginseng,9gFlosCarthami,30gRamulusSambucusWillamsii,15gRadixDipsaci)demonstratedthebestresultsinallthethreeassays.
Keywords:
Fracturehealing;
Herbalformulae;
Uniformdesign;
Cellassay
*通讯作者
梁秉中教授
香港中文大學中醫中藥研究所所長
香港沙田威爾斯親王醫院
公共衛生學院大樓五樓
中醫中藥臨床研究中心
電話852-********
傳真852-********
電郵:
pingcleung@cuhk.edu.hk
梁秉中教授的學術研究領域包括:
骨科、骨質疏鬆、顯微外科、公共衛生、中醫藥及通識教育等。
梁教授曾於期刊撰寫超過三百份關於科學的論文,亦是十七本書籍的作者。
另外,梁教授自一九八二年至今,曾擔任十一本國際醫學雜誌的編輯。
1.前言
传统中医认为,骨折损伤的治疗大致可以分为三个阶段,早期需以清热祛毒药抗炎止痛,缓解各种红,肿,热,痛并发症;
中期应重用活血化瘀药以促进血液循环和新骨再生;
后期利用接骨续筋药滋补肝肾,强筋接骨,以促进骨折的完全愈合和功能恢复。
中医的常规治疗包括使用局部外敷膏药,然后按症候转变,加以内服方剂治疗。
本研究目的是寻求适当外敷用药,同时证实外敷确能透过外皮进入损伤范围,产生疗效。
根据以上原则,将中药进行加减配伍,已有大量方剂被记载用于临床骨折的治疗[1]。
本研究查阅大量中医古籍和现代文献,选出大黄,栀子作为清热解毒君药;
三七,红花作为活血化瘀臣药;
接骨木,续断作为佐使组织愈合的药材,以均匀设计法配比药材用量,组成外敷复方[2-7]。
考察复方抗炎止痛,活血化瘀和接骨续筋的功效,优化剂量配比,并为中医骨伤理论提供科学依据。
2.材料与方法
2.1复方均匀设计与药材的提取
实验所用中药材均购于安徽亳州芳益堂药材有限公司,所购药材经显微和TLC鉴定均为药用品种,质量合格。
药材均留样于香港中文大学中医中药研究所(药材编号:
大黄,2007-3031;
栀子,2007-3032;
三七,2007-3033;
红花,2007-3034;
续断,2007-3035;
接骨木,2007-3036)。
将复方中三组不同功效中药的剂量设为待考察的三因素(功效相同的两味中药设为同一考察因素),将中国药典所提供的各药材的剂量范围[8]等分成五水平(同一因素内的两药材剂量取同等水平),选定均匀设计三因素五水平设计表U5(53)安排实验[9],得到五种配方(表1)。
将五组配方的药材分别用4倍体积的蒸馏水和95%乙醇加热回流提取,离心,取上清液真空浓缩并冷冻干燥,得到收率为17%和4%的水提物和醇提物干粉备用。
表1均匀设计U5(53)实验安排表
2.2细胞培养和细胞毒试验
小鼠巨噬细胞系RAW264.7,大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106,和人体静脉上皮细胞系HUVEC-12购自美国模式培养物集存库(ATCC,美国)。
RAW264.7和UMR-106以DMEM培养基(含10%胎牛血清、青霉素100kU·
L-1、链霉素100kU·
L-1,美国生命技术有限公司)培养,置37℃,5%CO2恒温培养箱中,每隔3~4d传代[10]。
HUVEC-12以DMEM/F12培养基[11](含10%胎牛血清、青霉素100kU·
L-1、0.1mg·
mL-1肝素和0.03mg·
mL-1的内皮细胞生长添剂,美国生命技术有限公司)。
取RAW264.7、UMR-106或HUVEC-12细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成每毫升含5x103个细胞的单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板(每孔100μL),每组设3个平行孔。
放置一夜后,加入阴性对照溶剂或供试样品溶液,共同培养24或48h后,于每孔加入5mg·
mL-1的噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司)30μL。
继续培养4h后弃去上清,吸干残留液,每孔加入DMSO100μL,振摇至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解后,用酶标仪(美国伯乐公司)测定540nm处吸光值,计算细胞生长率。
2.3一氧化氮(NO)释放试验
将每毫升含5X105个细胞的RAW264.7单细胞悬液接种于48孔培养板(每孔300μL),每组设3个平行孔。
放置过夜后,加入阴性对照溶剂或供试样品溶液,培养2h后,加入LPS(终浓度1μg·
mL-1,经预实验结果表明,RAW264.7在1μg·
mL-1的刺激下释放NO的量明显升高,约2.7倍,p<
0.05),置培养箱中培养24h后,吸取培养液上清100μL至酶标板中,加入等体积的Griess试剂(美国Sigma公司)。
室温反应5min后测定540nm处吸光值。
用浓度为0,3.1256.25,12.5,25,50,100μmol·
L-1的NaNO2绘制标准曲线,根据标准曲线计算细胞培养上清液中NO的浓度以及供试品对NO释放的抑制率。
2.4UMR-106和HUVEC-12细胞增殖试验
取UMR-106或HUVEC-12细胞,制成每毫升含5x103个细胞的单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板,每组设3个平行孔。
放置一夜后,加入阴性对照溶剂或供试样品,共同培养24或48h后,于每孔中加入3H-TdR0.5μCi继续培养6h,用多孔细胞收集仪(美国Packard公司)将细胞收集于玻璃纤维滤膜上,在液体闪烁示踪仪(美国PerkinElmer公司)上测定。
与阴性溶剂对照组相比,计算细胞增殖率。
2.5统计学分析
数据均以±
s表示,利用SPSS(13.0)对两組及两組以上的差异分別采用Mann-WhitneyU和Kruskal-WallisH检定;
实验数据进一步采用均匀设计软件(WUST5.0,中国东北制药总厂)进行多元回归,建立生物效应与药物剂量之间的关系方程。
所有检验的显著性界限水平定为0.05。
3结果与讨论
3.1复方提取物对RAW264.7细胞增殖和释放NO的影响
复方提取物对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7释放炎症因子(NO)和细胞生长的影响分别采用Griss颜色反应和MTT比色法测定。
结果表明,五组复方中,1、3和4号的水提物和醇提物分别在2000µ
g·
mL-1和240µ
mL-1的高浓度下显示出47.6%-57.6%的NO抑制作用;
2号、5号的水提物和醇提物分别在1000-2000µ
mL-1和120-240µ
mL-1浓度范围内表现呈现剂量依赖性的NO抑制作用,抑制率为47.8%-75.2%。
MTT试验中,五组复方的水提物和醇提物在0-2000µ
mL-1和0-120µ
mL-1范围内对巨噬细胞的生长具有显著的增殖作用,表明复方的NO抑制效应与细胞毒作用无关。
但复方对RAW264.7的增殖强度在2000µ
m
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