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患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一,也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。
产生自身抗体的抗原包括以下几种:
化学修饰的组织抗原;
与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原;
隐蔽抗原;
自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等,在一定条件下,均可刺激机体产生自身抗体。
自身抗体与疾病的关系:
某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性,已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体;
某些自身抗体与疾病的活动性有相关性;
少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。
测定自身抗体的意义:
自身免疫性疾病的诊断;
疾病活动性的判断;
疗效的观察;
指导临床用药等。
第二节 常见自身抗体的检测
自身抗体种类很多,这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。
一、类风湿因子
(一)概念
类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体,是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。
可与人或动物的变性IgG结合,而不与正常IgG发生凝集,最多见于类风湿性关节炎患者。
Rose等1984年在RA(rheumatoidarthritis)患者血清中发现RF。
RF有IgM、IgG、IgA和IgE型,IgM型为主要类型。
(二)检测方法
1.胶乳凝集试验:
以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上,如血清中含有RF,可与乳胶颗粒出现凝集反应。
该法只能定性或半定量,灵敏度及特异性不高,只能检测IgM型RF。
2.速率散射比浊法:
定量检测、准确、快速,准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。
也只能检测IgM型RF。
3.ELISA法:
可检出不同Ig类型的RF,在酶标记抗体时,分别标记IgG、IgA或IgM。
(三)临床应用
RF主要见于类风湿,在类风湿性关节炎患者中的检出率很高,RF阳性支持早期RA的倾向性诊断,对年轻女性应进行RA和风湿热的鉴别;
而对非活动期RA的诊断,需参考病史。
但RF也像ANA一样,并不是RA独有的特异性抗体。
在SLE患者约有50%RF阳性,在其他结缔组织病如SS、硬皮病、慢性活动性肝炎以及老年人中均可有不同程度的阳性率。
部分正常人也可出现。
但RF滴度或含量一般较低(<
40IU/ml)。
RF无严格特异性,不是RA的唯一诊断标准。
RF阴性不能排除RA。
IgM型RF:
>
80IU/ml伴严重关节功能障碍者,提示预后不良。
IgG型RF:
与患者滑膜炎、血管炎和关节的症状密切相关。
正常人以及非RA患者中很难检出。
IgA型RF:
10%RA可检出,为RA临床活动的指标,与骨质破坏以及关节炎症状的严重程度显著相关。
IgE型RF:
在关节液、胸水中高于血清水平。
二、抗核抗体
抗核抗体(antinuclearantibody,ANA)是以自身真核细胞成分作为靶抗原的一组自身抗体的总称,泛指各种核成分的抗体,是一种广泛存在的自身抗体。
迄今已发现20余种。
性质主要是IgG,也有IgM、IgA、IgD和IgE,可与不同来源的细胞核起反应,无器官特异性和种属特异性。
ANA主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液以及尿液等体液中。
ANA可见于多种疾病,主要存在于自身免疫性疾病患者血清中,如SLE、SS、MCTD、类风湿性关节炎等。
也可见于慢性肝病、病毒感染以及正常老年人、妊娠妇女等。
ANA阴性不能排除自身免疫性疾病的诊断;
阳性也不一定是自身免疫性疾病。
由于细胞核成分的复杂性,不同成分的抗原性也不同;
因此就会有多种不同类型的ANA。
ANA在不同的疾病中呈现不同的组合,不同的疾病有自己的抗核抗体谱。
有些ANA只是针对某一特定成分,只在某一疾病中出现,成为该病的血清标志性抗体。
ANA是一个重要的筛选试验。
分类:
按理化特性和抗原分布部位分为四大类。
包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体。
命名:
1.根据抗原化学名称命名:
例如抗dsDNA、抗RNP。
2.以第一位检出患者命名:
例如抗Sm、抗Ro、抗La抗体。
3.以相关疾病命名:
例如抗SSA、抗SSB抗体。
(一)检测方法
由于ANA的复杂性及多样性,故测定方法繁多。
目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。
常用间接免疫荧光法(indirectimmunofluorescence,IIF)作为总的ANA筛选试验。
鼠肝常用于检测抗核抗体,但近十年来多被HEp-2细胞所代替,这是因为HEp-2细胞具有以下特点:
人源性;
细胞核大;
分裂期细胞多;
可大批量培养。
当然,单个细胞不可能替代组织切片,所以鼠组织切片仍继续用于自身抗体的检测。
放射免疫法:
常用于检测抗DNA抗体,有Farr法及过滤法。
①Farr法的原理为用同位素标记DNA,被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合,经50%硫酸铵饱和液沉淀,然后比较沉淀物和上清液中的放射活性,从而得出DNA结合活性,一般结合率大于20%为阳性。
②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器(孔径为0.45μm)进行过滤,游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。
ELISA法:
临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体,其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。
目前已有试剂盒供应。
免疫印迹(immunoblotting)法:
先将混合抗原作凝胶电泳,分离开不同的区带,然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上,最后用酶标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。
由于该试验不需纯化的单个抗原,可在同一固相上作多项分析检测,灵敏度高,特异性强。
故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测,如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。
另外,还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。
这些试验要求的实验条件比较低,但敏感性也比较低。
均质型
斑点型
核仁型
核膜型
(二)常见ANA荧光图形及临床意义
1.均质型:
多是由抗DNP抗体所引起。
也可由核小体抗体和抗双链DNA抗体引起。
主要见于SLE,药物性狼疮。
2.斑点型:
是由抗ENA抗体所引起。
主要见于SLE、MCTD、PSS、SS等。
高滴度的斑点型常见于MCTD。
3.周边型(又称核膜型):
主要由抗dsDNA的抗体所引起。
主要见于SLE。
特别是活动期患者。
4.核仁型:
主要见于硬皮病。
相关抗体是抗核仁特异的低分子量RNA等。
5.着丝点型:
主要见于局限性硬皮病及CREST综合征。
主要的靶抗原是着丝点B抗原。
(三)抗双链DNA抗体的检测方法
检测抗DNA抗体的方法有多种,如ELISA、IIF、金标法、免疫印记法、放免法等。
其中最特异敏感的是应用锥虫或血鞭毛虫(如绿蝇短膜虫)作基质测定抗dsDNA抗体。
因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA,无其他抗原干扰;
在阳性结果时,可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。
因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。
另外,短膜虫对人畜无害,可以人工养殖,来源方便,值得推广。
抗dsDNA抗体是SLE的特征性标记抗体,是SLE活动期的重要指标。
抗体滴度的动态检测对疗效的监测提供了有价值的实验室手段。
抗dsDNA抗体对诊断SLE特异性较高;
可达95%以上,但敏感性较低,仅为30%~50%,因此,抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。
抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起到重要作用。
如狼疮肾炎;
血管炎;
皮肤的蝶形红斑等均与该抗体有关。
三、抗ENA抗体谱
(一)概述
ENA(extractablenuclearantigens)是可提取性核抗原的总称。
ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。
ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。
不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。
ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。
检测方法有多种,如免疫印迹法(immunoblotting,IBT)、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。
这里主要介绍免疫印迹技术。
免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术,其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。
其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA,经过SDS-PAGE电泳分成区带,然后转印至硝酸纤维膜上,将待检血清(含抗ENA抗体)加在硝酸纤维膜上,抗ENA抗体与ENA抗原结合,形成Ag-Ab复合物,加入酶标抗人IgG,形成Ag-Ab-酶标Ab复合物,然后加入底物显色。
与标准条带对比判读,可以确定不同的抗ENA抗体。
免疫印迹技术不需纯化抗原,灵敏度高,特异性强,操作简便,是广泛采用的检测抗ENA抗体的技术。
图1ENA自身抗体谱标准对照带
(三)抗ENA抗体的临床意义
1.抗Sm抗体:
是SLE的血清标志抗体,阳性率30%~40%。
阴性不能排除SLE的诊断。
抗Sm抗体水平与SLE活动性没有相关性,也不与临床表现相关,治疗后的SLE患者也可呈现抗Sm抗体阳性。
抗Sm抗体的检测对早期或不典型的SLE以及治疗后的SLE的回顾性诊断具有帮助。
2.抗核RNP抗体:
高滴度的抗核RNP(nRNP)抗体是MCTD诊断的重要依据。
因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物,故称U1RNP。
MCTD阳性率可高达95%。
也可见于其他自身免疫性疾病。
因为Sm与RNP为同一分子复合物(RNA-蛋白质颗粒)中的不同抗原位点,因此两种抗原具有相关性,常伴随出现,单一的抗Sm抗体阳性者较少见。
3.抗SSA/Ro/抗SSB/La:
是干燥综合征(SS)最常见的自身抗体,抗SSB特异性较SSA高。
两者同时检测可提高SS的诊断率,抗SSA抗体也可见于SLE和其他自身免疫病,亚急性红斑狼疮患者、补体缺陷的SLE患者、新生儿狼疮患者可以出现抗SSA抗体。
IgG类抗SSA抗体通过胎盘进入胎儿后,可引起新生儿狼疮综合征,出现典型的SLE皮损。
抗SSA抗体与胎儿的心脏传导系统结合,可以造成先天性心脏传导阻滞。
4.抗Jo-1抗体:
最常见于多发性肌炎(polymyositis,PM)。
在其他AID一般为阴性。
PM与硬皮病重叠者阳性率较高。
5.抗Scl-70抗体:
几乎仅见于进行性系统性硬化病(progressivesystemicsclerosis,PSS),阳性率40%~60%,其他AID少见,是PSS的标志性抗体。
正常人为阴性。
四、抗中性粒细胞胞浆抗体
抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophilcytopl
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