高效液相色谱法原理与应用(详细版)PPT资料.ppt

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63、色谱法的分类按流动相状态的不同，可分为按流动相状态的不同，可分为气相色谱法气相色谱法（GC）液相色谱法液相色谱法（LC）超临界流体色谱超临界流体色谱（SFC）7什么是气相色谱法？

以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法GasChromatogaphy，简称简称GC适合分离分析适合分离分析易汽化易汽化（在（在-190-500范围内有范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反稳定、不易分解、不易反应应的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于同系物、同分异构体同系物、同分异构体的分的分离。

离。

8应用举例（应用举例（GC）9什么是液相色谱法？

以液体为流动相的色谱法以液体为流动相的色谱法LiquidChromatogaphy，简称简称LC适适合合分分离离分分析析高高沸沸点点、热热不不稳稳定定、离离子型的样品。

子型的样品。

10按按固固定定相相使使用用的的形形式式可可液液相相色色谱谱法法又又可可分为：

分为：

柱色谱（柱色谱（ColumnChromatography）将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内纸色谱（纸色谱（PaperChromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（薄层色谱（ThinLayChromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上11TLC的应用123456789BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1人参、西洋参和三七药材的鉴别人参、西洋参和三七药材的鉴别12丹参药材有效成分的HPLC图谱1.Danshensu;

2.Protocatechuicacid;

3.Protocatechualdehyde;

4.Caffeicacid;

5.SalvianolicacidF;

6.SalvianolicacidD;

7.SalvianolicacidJ/isomer;

8.SalvianolicacidE;

9.Rosmarinicacid;

10.Lithospermicacid;

11.SalvianolicacidB;

12.SalvianolicacidB/E/isomer;

13.SalvianolicacidA;

14.DihydrotanshinoneI;

15.Tetrahydrotanshinone/isomer;

16.Cryptotanshinone;

17.TanshinoneI;

18.TanshinoneIIA1234568710911121615141317181314p拖尾峰拖尾峰p伸舌峰伸舌峰p鬼峰、假峰鬼峰、假峰p畸峰畸峰p峰底峰底p基线漂移基线漂移p基线噪声基线噪声p谱带扩张谱带扩张15p死时间死时间（tM）:

）:

完全不保留组分流出系统的时间p保留时间保留时间（tR）:

p调整保留时间调整保留时间（tR）:

p死体积死体积（VM）:

p保留体积保留体积（VR）:

p调整保留体积调整保留体积（VR）:

16R:

分离度tR:

保留时间t0：

死时间W：

峰底宽度2.色谱分离基本方程色谱分离基本方程17不同不同R值的峰重叠情况示意图值的峰重叠情况示意图R1.5可以得到基线分离分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度R太小，两个峰无法彻底分离R太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定18根据该公式优化试验条件，提高分离度R。

从数学推导来看，分别增大n，k值，都可以提高分离度。

色谱分离基本方程色谱分离基本方程19分离选择性（分离选择性（）对分离度（对分离度（R）的影响的影响如果t0=1min=1.64/1.58=1.04=1.15/0.85=1.35=0.95/0.63=1.50改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法改用不同的流动相改变流动相的组成并非必须大于并非必须大于1.5！

改变流动相pH值尽量优化前几种实验条件提高a值，改变柱温避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本应用特殊的化学效应改变固定相20柱效（柱效（n）对分离度（对分离度（R）的影响的影响以上两张谱图k，,值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。

直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低21理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n理论塔板数n越大，柱效越高；

理论塔板数HETP越效，柱效越高22容量因子（容量因子（k）对分离度（对分离度（R）的影响的影响容量因子越大，分离度越大。

容量因子越大，分离度越大。

k135791113k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但当容量因子大于但当容量因子大于10，k/（k+1）的改变不大，而分析时间将的改变不大，而分析时间将大大延长。

因此，大大延长。

因此，k的最佳范围是的最佳范围是1k20。

改变容量因子的方法有：

改变柱温改变柱温改变柱死体积，其中改变柱死体积，其中死体积死体积对对k/（k+1）的影响很大。

的影响很大。

改变流动相的配比是最简便、最有效的方法改变流动相的配比是最简便、最有效的方法梯度洗提梯度洗提容量因子容量因子23梯度洗提梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。

优点：

分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。

缺点：

检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。

柱子需进行再生处理。

2425装置装置低压梯度（内梯度）：

溶剂在常压下混合，再用高压泵输送至柱系统。

简单、经济，只需一个泵，所用溶剂的元数没有限制。

高压梯度（外梯度）：

一般由两台高压泵构成，每台泵输送一种溶剂。

溶剂在混合室混合后，在输入柱系统。

流量精密度高，溶剂的可压缩性和热力学体积的变化可能影响输入柱子中溶剂的组成。

26溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A高压泵B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图27实现方式实现方式对于复杂样品，线性梯度是最好的。

正相色谱中，常用二氯甲烷加入正己烷来实现。

反相色谱中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。

28温度的影响温度的影响n，k都会受到柱温的影响不要使用过高温度，以保护柱子，60度算高温温度对平衡常数有影响，有时会影响出峰顺序影响出峰顺序，注意对化合物进行定性后再定量升温通常可以加速分离，缩短分析时间，但也不绝对29三、色谱定性与定量方法301.色谱定性分析

（1）纯物对照定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。

31实现方法利用保留时间和保留体积定性32用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性33应用范围：

适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。

应用简便，不需要其他仪器。

定性结果的可信度不高。

提高可信度的方法：

双柱、双体系定性34

（2）与其它仪器或化学方法联合定性离线联用方式化学法仪器法在线联用方式化学法仪器法35离线联用方式收集方法：

馏分收集器应用范围：

无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：

麻烦36在线联用方式与其它仪器联用定性混合物经色谱分离后，将各组分直接由接接口口导入其它仪器中进行定性。

常用的联用方法有：

LC-FTIR、LC-MS其它仪器相当于色谱仪的检测器。

色谱仪的检测器。

使用范围：

复杂样品的定性。

不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。

需要特殊仪器或设备。

372色谱定量分析

（1）色谱定量基础色色谱谱定定量量分分析析是是基基于于被被测测物物质质的的量量与与峰峰面面积成正比积成正比。

在一定色谱条件下有：

38

（2）定量要解决的问题）定量要解决的问题峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用39峰面积的测量与计算积分仪或色谱工作站积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。

手动测量与计算手动测量与计算40峰高乘半峰宽法：

适于对称峰峰高乘峰底宽度法：

适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法：

适于不对称峰峰高乘保留值法：

适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。

41n重叠峰的测量切线分峰垂线分峰42连线分峰计算机拟合分峰43校正因子的测量与计算相对校正因子相对校正因子由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子相对校正因子。

44质量校正因子摩尔校正因子相对响应值被测组分被测组分的质量的质量标准物质量标准物质量分子量分子量45定量方法校正归一化法含归一化内标法含内标标准曲线法外标法含单点校正46n校正归一化法推导推导：

47应应用用范范围围：

当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。

优优点点：

简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。

缺点缺点：

对该法的苛刻要求限制了它的使用。

48面积归一化法若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：

49n内标法推导推导将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。

单点校正50适用范围：

适用范围：

当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。

受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。

缺缺点点：

每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。

51内标标准曲线法（多点校正内标法）fi,sms/m为常数K，此时Ci%=K（Ai/As），以Ci%对Ai/As作标准曲线。

不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。

52n外标法（标准曲线法）用于常规分析用于常规分析优优点点：

操作简单，计算方便。

结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。

该法必须定量进样。

53单点校正当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。

即配制一个与