TUNEL染色.docx
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TUNEL染色
相关疾病:
∙
产品名称:
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称:
Tunel产品货号:
产品规格:
50T试剂级别:
试剂级产品产地:
USA产品商标:
RocheInsitucelldeathdetectionkit-POD法一、原理:
TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。
其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶(TdTEnzyme)的作用下,能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH结尾,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radishperoxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反映产生很强的颜色反映(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因此没有3‘-OH形成,很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评判,和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。
二、器材与试剂器材:
光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;试剂:
试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:
PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS)、ProteinaseK工作液(10-20μg/mlin10mMTris/HCl,pH)或细胞通透液(%TritonX-100in%sodiumcitrate,临用前配制)、苏木素或甲基绿、DNase1(3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl,pH,10mMMgCl2,1mg/mlBSA)等。
三、实验步骤操作流程图:
制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤(石蜡包埋切片的检测):
1.用二甲苯浸洗2次,每次5min;2.用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;注:
上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C(温度、时刻、浓度均需试探)或加细胞通透液8min;5.PBS漂洗2次;6.制备TUNEL反映混合液,处置组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μlDNase1,反映在15~25℃×10min,后面步骤同处置组。
7.玻片干后,加50μlTUNEL反映混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×1h。
8.PBS漂洗3次;9.能够加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);10.玻片干后加50μlconverter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×30min。
11.PBS漂洗3次;12.在组织处加50~100μlDAB底物,反映15~25℃×10min;13.PBS漂洗3次;14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后当即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观看凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。
可结合凋亡细胞形态特点来综合判定(未染色细胞变小,胞膜完整但显现发泡现象,晚期显现凋亡小体,贴壁细胞显现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)关于培育细胞的预处置:
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸(见备注4),干燥后在去离子水中漂洗,干燥后4℃保留;②适当方式诱导细胞凋亡,同时设未经诱导的对照组,各组离心搜集约1×106个细胞,PBS洗一次,重悬,加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上,自然干燥,使细胞专门好的吸附到载玻片上;③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛(见备注2)中固定25min;④PBS浸洗二次,每次5min;⑤将吸附细胞的载玻片在%的TritonX-100(见备注5)中处置5min;⑥PBS浸洗二次,每次5min;后续操作犹如石蜡包埋切片的6—15四、注意事项1.进行PBS清洗时,每次清洗5min。
2.PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4.TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。
不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。
5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。
6.用甲基绿(MethylGreen)染液(3-5%甲基绿溶于醋酸巴比妥)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。
然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观看操作。
若是现在利用80~90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。
7.荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。
8.试剂保留;未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃);converter-POD液一旦解冻,以后就保留在4℃(2~8℃)下,至少在6m内稳固,幸免再次冻存;TUNEL反映液临用前配好后,放至冰上直至利用。
9.结果分析时注意:
在坏死的晚期时期或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断,从而引发假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,和细胞外的矩阵成份阻止TdT进入胞内反映,进而产生假阴性结果。
能够选择利用Biotium公司的Tunel试剂盒,是荧光法的成效超级的好,价钱也有优势,若是有需要能够联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理,另外还有生物素标记的dUTP试剂(包括不同连接臂长度的产品),能够为您的实验提供更多的选择性,希望能够帮到您!
A、B二液混合,30μl/每片37℃1h
PBS洗3×3min
Streptavidin-HRP1:
20037℃30min
PBS洗3×3min
%DAB+%H2O2显色10min,水洗
苏木素衬染1min,水洗蓝化
吹干后常规树脂封片
观看:
凋亡指数(apoptosisinde×,AI)在一般光镜下持续观看10个高倍视野计数阳性细胞数,换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数,即为AI。
其他
IRAM:
我在做Tunel检测细胞凋亡,用的是Roche公司的试剂盒,步骤如下:
细胞固定(4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时)--3%H2O2in甲醇室温10分钟%-100in%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反映混合物,37度湿盒90分钟--加入POD,37度湿盒40分钟--加入DAB100微升,室温10分钟--苏木素2分钟。
其间每步均用PBS洗涤3次,共5分钟。
我做了两次,但成效均步理想,好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞(我的细胞应该是有凋亡的),因为试剂有限未做阳性对照,阴性对照结果与实验组无明显差距,实在不明白是怎么回事。
是我的试剂没有配对仍是染色出了问题?
Nevin:
因为我也在用tunel检测细胞的淍亡,看了你的步骤后,提几点意见:
一、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方式仿佛有点问题,我以为H2O2的浓度偏高,有两种选择:
A,%H2O2in甲醇;或B,3%H2O2。
请注意浓度的转变。
因为H2O2会减弱TdT的活性,可致假阴性。
二、加入TUNEl反映液,要新鲜配制,后放置冰浴中备用。
这也是tunel成功的关键。
3、能够用蛋白酶K消化试试。
totoo:
我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测,用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反映。
蛋白酶k消化的浓度20ug/ml.10ug/度30分钟。
我的正常的角膜应该有阳性的结果,可是没有阳性?
midas:
对角膜进行的什么处置?
能够先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照,若是能够染出来那么能够证明您的盒子应该是没有什么问题的。
totoo:
我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照,阳性对照出结果,而我做的角膜片子而不出结果
pljgirl:
请教列位大侠:
有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗?
我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反映,可是他们得石蜡阳性片我染的专门好,确实是细胞片不怎么着色?
我做Tunel时,加TDT标记液是37度2小时,之前加蛋白酶K消化30秒,没加Trtrion,因为试剂盒没要求,博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用,这些操作步骤合理吗?
newfish:
我用的是中山的蛋白酶K不是石蜡片采纳么?
细胞不用吧!
做那个实验有几个关键的地址,不能干片固定咱们一样用4%多聚甲醛30分钟。
染色时不要只是看试剂盒怎么说,还要一张一张染,在镜下观看看到染上了再终止。
另外你能够用苏木素复染!
!
DONGHAIJU:
我此刻正在做细胞凋亡的TUNEL检测,用的是Boehringermannheim公司的试剂盒,结果还不错,3600元50次反映,你的实验步骤是如何进行的?
可否写下来讨论一下缘故?
刚开始我的实验也是没有结果,后来改变的实验步骤,结果就出来了,成效也不错。
我的实验步骤可能如下:
一、石蜡切片脱蜡至水,
二、%H2O2的甲醇液室温作用5分钟,lPBS清洗两次,每次5分钟
3、20ug/ml蛋白酶K处置,湿盒内37℃孵育30min,PBS清洗,
4、加入TUNEL反映混合液50ul,盖上蜡膜,湿盒内37℃孵育1小时,PBS清洗,
五、3%BSA室温作用20min,PBS清洗
六、POD转换液50ul,盖上蜡膜,湿盒内37℃孵育30min,PBS清洗
7、DAB显色5~10min,自来水冲洗,
八、苏木素复染,盐酸酒精分化20s,自来水冲洗20min,
九、梯度脱水50%,70%,80%,90%,100%
(1),100%
(2),2min/次
二甲苯透明两次,10min/次,中性树胶封固,镜下观看。
大灵通:
我想做细胞爬片,然后加不同浓度增进凋亡的药物,然后做TUNEL检测凋亡情形。
问题有二:
一、随药物浓度升高,凋亡比例愈来愈高(我做流式取得的结论),可是很多调亡细胞都漂了,那会可不能阻碍TUNEL结果?
不明白我说明白没有?
确实是说尽管调亡细胞增多,可是漂的愈来愈多,玻片从培育液里拿出来细胞都留在培育液里了!
可是文献上也都是这么做的呀。
他们的细胞莫非凋亡了也都留在片子上的么?
二、在用4%多聚甲醛固定细胞时,4%多聚甲醛是4度的仍是常温的?
我用的是博士德的试剂盒,没说要4度,文献上有的写用,有的没提,我到底用不用呢?
zhaoqingshan:
其实,确实是如此的,凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候,或许在分岔口就已经离开贴壁了。
有两点建议:
一、听说国产的TUNEL试剂盒质量不太好,我以前用的是Roche的;
二、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可;
3、显然,凋亡的细胞大多数已经离开玻璃片了,因此应该把漂浮起来的细胞搜集,然后甩片
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- TUNEL 染色