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原理
光照射到某些原子时,光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了半径更大的轨道,即从基态变到了第一单线态或第二单线态等。
第一单线态或第二单线态等是不稳定的,所以会恢复基态,当电子由第一单线态恢复到基态时,能量会以光的形式释放,所以产生荧光。
同步荧光法技术是由Lloyd首先提出的,它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。
由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图,称为同步荧光光谱。
同步荧光法按光谱扫描方式的不同可分为恒(固定)波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。
1.恒波长同步荧光分析法
恒波长同步荧光法系在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔(Δλ=λem-λex=常数),即通常所说的同步荧光法,是最早提出的一种同步扫描技术。
在恒波长同步荧光法中,Δλ的选择十分重要,这将直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度。
在可能条件下,选择等于斯托克斯位移的Δλ。
恒波长同步荧光光谱法较多用于多组分多环芳烃的同时测定。
多环芳烃性质很相似,尽管有强的荧光,但各种化合物的激发和发射光谱往往光谱重叠严重,用经典荧光法难以进行混合物的直接分析。
同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点,可用于多组分多环芳烃混合物的同时测定。
2.恒能量同步荧光分析法
恒能量同步荧光光谱法(CESLS)由Inman和Winefordner于1982年提出。
它在克服拉曼光、提高分析灵敏度方面均有显著效果,具有其他同步荧光法所没有的独特优点。
恒能量同步荧光法系在激发波长λex和发射波长λem的同时扫描过程中保持两者一恒定的能量差Δ?
关系。
该法以荧光体的量子振动跃迁的特征能量为依据来进行同步扫描,若选择一固定能量差Δ?
等于某一振动能量差,则在同步扫描中,当激发能量和发射能量刚好匹配一特定吸收2发射跃迁条件时,该跃迁处于最佳条件,由此产生的同步光谱可达最大强度。
恒能量同步荧光法对于多环芳烃的鉴别和测定特别有利。
恒能量同步荧光法的光谱优点可以以定量形式来表达并用来选择扫描参数,从而为体系的参数优化提供了便利。
3.可变角同步荧光分析法
可变角同步荧光法是在测绘同步光谱时,使激发和发射两个单色器以不同的速率或方向同时扫描。
该方法可分为线性与非线性两类:
线性可变角同步荧光法的扫描路径表现在等高线图中为一条不为45°
的直线;
而非线性可变角同步荧光法其扫描路径表现在等高线图中为折线或任意曲线。
非线性可变角同步荧光扫描时,不但要求激发、发射两个单色器能以不同的速率和不同的方向进行扫描。
该方法能使扫描路径方便地有选择性地通过各点,因而获得极佳的光谱分辨。
李耀群等提出了利用可变角同步荧光法克服二次散射光干扰的设想,并且探讨了适宜于包括可变角同步荧光光谱在内的波长域同步谱的理论计算式。
导数技术和可变角同步荧光法的联用可进一步提高分析的灵敏度和选择性。
4.恒基体同步荧光分析法
1994年Murillo2Pulgarin等[112]提出了恒基体同步荧光法。
它也可被认为是非线性可变角同步荧光法的一种,其扫描路径在等高线图中表现为一曲线,巧妙的是该曲线是基体(将干扰物视为基体)的等荧光强度线。
该方法一般与导数技术联用[113],沿着等高线扫描,再结合导数技术就可以消除基体的干扰。
其基本原理是:
在等高线图上把基体的荧光强度相等的各点连接起来形成等高线(等荧光强度线),沿着基体的等高线扫描,则在整个扫描过程中基体的荧光强度相等。
由于整个扫描过程基体的荧光强度一致,当结合导数技术微分后,基体的导数信号为零。
在混合物中沿着测定路径(干扰物或基体的等高线)扫描时所得的信号通常是混合物的总的荧光信号,既包括待测物的信号,又包括干扰物(基体)的信号。
但由于是沿干扰物(基体)的等高线扫描,荧光信号求导后,干扰物(基体)的干扰就得到了消除,扫描所得的导数信号则是被测物的净信号。
分析应用
同步荧光分析法是提高分析选择性,解决多组分荧光物质同时测定的良好手段之一[5,28]。
最早发展起来的恒波长同步荧光法在一般的荧光分光光度计上均可方便实现,已在环境、医药、卫生和生物等领域获得广泛的应用,而新近发展的各种新型同步荧光方法正显示出独特的作用,越来越得到人们的重视。
1环境分析
同步荧光检测技术已成为环境污染监测中多环芳烃的定性和定量分析的有效手段[29~44]。
恒波长同步扫描能够对包括含蒽、苯并[b]、苯并[a]、笨并[e]芘、窟、二苯[a,h]蒽、硫芴、荧蒽、芴、菲、芘、苝和丁省等多至13种主要的痕量多环芳烃进行鉴别。
恒波长同步荧光测定法应用于空气气溶胶的分析,可鉴别出多种多环芳烃。
恒能量同步荧光法在分析大部分多环芳烃时,有其明显的优越性,亦已用于汽车发动机的尾气、空气样品、环境水样中的多环芳烃的光谱指纹鉴别和定量分析。
恒能量同步荧光法结合导数技术,可有效提高多环芳烃的光谱指纹分辨率和分析灵敏度,已用于分析二氢苊、蒽、苯并[a]、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽等18种多环芳烃。
低温恒能量同步荧光法使光谱准线性比,用于对多环芳烃同分异构体和芳烃同系物进行光谱分辨,取得满意结果。
多环芳烃的同步荧光分析既可在有机介质中进行,也可在胶束体系中进行,后者可减少不同多环芳烃之间的能力传递。
许多多环芳烃的降解产物也能用同步荧光法来分析【45~48】,这些降解产物可作为多环芳烃暴露的生物标志物。
尿中1-羟基芘是反映人体接触环境多环芳烃程度的一个灵敏而是用的指标,但尿样本体荧光对1-羟基芘的检测有相当大的干扰,采用恒基体同步荧光法可克服其影响,不经分离直接分析。
用恒波长同步荧光法可检测鱼胆汁中的1-羟基芘以及测定芘的生物降解率。
除多环芳烃分析外,同步荧光技术在其他环境分析方面也有诸多报道【49~52】。
原油污染的检测和表征,对海洋、土壤环境保护特别重要。
研究表明,同步荧光技术很有希望成为海洋、土壤中鉴别油漏的诊断工具。
另外,同步荧光法在许多环境污染物入1-萘酚、2-萘酚、苯酚、苯胺、对苯二酚、间苯二酚等以及他们的混合物分析中都显示出良好的效果,简便快速。
与常规荧光分析法相比,同步荧光法可明显且更有效地区分河水中的富里酸和腐蚀酸。
2药物、临床和生化分析
药物分析和临床分析中经常会遇到如各种药剂成分之间相互干扰或血清、尿样背景干扰等问题,同步荧光法可有效消除或降低这些干扰的影响。
利用导数同步荧光光谱法可直接测定尿样中的洛美沙星、痕量氧氟沙星、三种b族维生素、尿液中的肾上腺素和去甲肾上腺素、人体血清中的甲氧萘丙酸和水杨酸、血浆中的毒品及其代谢产物等等。
乙氧萘胺青霉素和2,6-二甲氧基苯青霉素荧光光谱相似,但用恒波长同步扫描技术结合最小二乘法、一阶导数恒波长或一阶导数恒能量荧光法测定,均可实现同步分析,其中导数恒能量同步荧光法效果最好。
利用非线性可变角和导数可变角同步荧光法可同时测定混合溶液中的吡哆醛、吡哆胺、维生素B6以及分析血浆、尿样中的水杨酰胺等。
恒基体同步荧光法不仅能有效地消除复杂体系中背景荧光的干扰,实现生物基体中各组分的直接测定,而且对荧光光谱重叠的二组分的同时测定也是非常有用的。
恒基体同步荧光法以用来测定血清中的水杨酸、尿样中的各组分如水杨酸、2,5-二羟基苯甲酸、维生素B6以及奎尼定、粪样中的原卟啉和粪卟啉等等。
同步荧光法以用于研究蛋白质与各种物质的相互作用[64-67],国内尤其在这方面多的工作。
如同步荧光光谱法可明确分辨脱铁运铁蛋白的铬氨酸和色氨酸残基的荧光(采用不同波长差),当用于考察铽(Ⅲ)在脱铁运铁蛋白上的结合时,由所得铽(Ⅲ)对脱铁运铁蛋白铬氨酸和色氨酸残基荧光猝灭的相对程度,就可得知铽(Ⅲ)的强结合部位包含铬氨酸残基。
利用各种不同荧光探针技术(如量子点、卟啉等),结合同步荧光法,可量分析蛋白质和核酸。
同步荧光技术还可用于不同基因的分型、正常细胞和肿瘤细胞的区分等,如以不同荧光染料分别标记野生型基因和突变型基因双链探针,利用同步荧光光谱,减少标记染料的光谱重叠,对PCR反应产物进行终点检测,可建立一种廉价、快速的筛查遗传性血色病基因突变的方法。
3化工分析
可以用同步荧光光谱来表征不同物品来源,进行指纹识别。
食用油中含有各种荧光成分,利用恒波长同步荧光光谱,已对不同食用油进行分类【73】。
不同来源的轮胎由于加工制作很磨损情况不同,轮胎胎面锁包含的填充剂、加工处理油、抗氧剂很多环芳烃等组分会有所改变,导致其光谱也发生变化,由此利用同步荧光光谱就可以区分不同种类的轮胎。
恒能量同步荧光分析法也已用于分析褐煤高温分解所得焦油的芳烃结构特征【74】。
同步荧光光谱技术在油漆勘探【75~77】和石油产品分析【78~81】中已显示出良好的应用前景。
原油中的荧光主要来自其芳香烃成分,这些成分及其复杂,是由一系列烷基芳烃、环烷芳烃及杂环芳烃的混合物,同步荧光光谱不可能把所有的化合物区分开,但可以根据已知结构芳香化合物的特征峰位对芳烃的环数进行分类。
同步荧光法测定原油样品中的芳烃,可以判断原油的属性和成因类型,以及原油成熟的程度。
分析石油、天然气及石油有关的样品如钻井岩屑、土壤和油田水样的恒波长同步荧光光谱和恒能量同步荧光光谱,对不同性质油漆的荧光光谱特征进行归类,找出油气的典型光谱特征,可为选取油气勘探靶区提供有效的依据。
对18种原油成熟度分析的结果表明,总同步荧光光谱可提供丰富的信息。
有光石油产品分析,同步荧光光谱法已成功地用于鉴别各种石油产品如柴油、汽油、煤油和润滑油等。
同步荧光峰峰位置随着马达油浓度的增加而发生红移。
借此可在一定浓度范围内定量马达油的含量。
在亚洲南部,柴油和汽油被煤油污染是一个严重问题,随着煤油含量的增加,柴油同步荧光光谱呈有规律蓝移,而汽油同步荧光光谱呈有规律红移,一次同步荧光法可用于定量考察煤油污染程度。
对石油产品中的芳香烃进行选择性猝灭,利用同步荧光光谱可清楚地解释猝灭剂对荧光团的影响情况。
对各种不同减压渣油进行恒波长同步扫描,所得同步荧光光谱能较好地反映出各极性和芳香度不同的组分的芳香环系大小。
恒能量同步荧光法结合低温技术用于指纹识别石油产品呈现出比常温条件下更强的分辨力。
4、参考文献
[1]LloydJ.B.F.Nature(London),1971,231:
64.
[2]Vo-DinhT.Anal.Chem.,1978,50:
396.
[5]何丽芳等.化学进展,2004,16(6):
879.
[6]InmanE.L.etal..,1982,54:
2018.
[7]InmanE.L.etal.Anal.Chim.Acta,1982,138:
245.
[8]李耀群等.分析化学,1989,17(12):
1154.
[9]Cla
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