RNAi在抗病毒中的应用(修改)Word格式文档下载.doc
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1.RNAi简介
1.1.什么是RNAi
RNAi是一种通过导入双链RNA(dsRNA)引起生物体或细胞内同源mRNA降解,从而导致同源基因沉默的生物学现象。
导入的dsRNA在细胞内被一种称为Dicer的核酶(RNaseⅢ)[1]裂解成长约21~23个核苷酸(nt)的小分子干扰RNA(siRNA)[2],siRNA随后与胞浆蛋白质成分结合成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),活化的RISC可通过反义siRNA的碱基配对与同源mRNA结合并使其降解。
1.2.RNAi的发现
RNAi最初在植物和真菌中发现,随后在线虫及果蝇的研究中发现并得到更深入的研究,后来在人类及哺乳动物中也发现了该现象。
1990年,Jorgensen等为使喇叭花紫色加深,将一种产色素基因置于一个强启动子后导入喇叭花,结果喇叭花紫色反而变得更浅甚至成白色。
这种导入基因与同源性内源基因表达同时受抑制的现象,被称为“共抑制(cosuppression)”。
发生在喇叭花的共抑制现象实质上是一种转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。
最初,研究者认为这可能是一种局限于喇叭花及少数几种植物的特有现象,但随后通过线虫及果蝇等的研究发现这是一种普遍纯在的现象。
1995年,Guo等在研究线虫par-1基因功能时发现注射正义RNA和注射反义RNA一样能封闭par-1基因表达[3]。
1998年,Fire等将正义和反义链混合的dsRNA导入线虫并发现与单独注射正义或反义链相比,注射dsRNA引起基因沉默的效率高得多[4]。
这种现象后来就被称为RNA干扰。
1.2.RNAi的机制
RNAi的机制首先被注意到与内源mRNA的降解有关。
当线虫接触到dsRNA时,其内源同源的mRNA的水平迅速下降。
而如果dsRNA序列是某个基因的启动子序列,则没有明显的抑制效应。
Hammond等人认为可能是dsRNA诱导了一种序列特异性的核酸酶的产生,这种核酸酶称为RNA诱导的沉默复合物(RISC),需要RNA和蛋白质两种成分存在,从而诱导特异的mRNA降解。
这种沉默复合物后来通过生化方法已经从果蝇细胞提取物中分离出来。
然而,后来的一些研究表明RNAi可能还牵涉到更加复杂的机制。
在植物中,双链RNA可以使靶基因在基因组上的序列甲基化,在果蝇、线虫和真菌上的实验表明,RNAi的机制可能还与染色质的结构改变有关。
在线虫上还发现,内源编码的RNAi诱导物,如lin24基因的产物,也会在转译水平上抑制基因的表达。
具体来说,现在认为主要有以下几种机制。
1.转录后沉默机制:
RNAi应用和研究中最重要的机制。
据此模型,基因沉默的第一步是通过某种机制来识别dsRNA并使之转换成21~23nt的siRNA。
siRNA的出现是RNAi及其他基因沉默现象最重要的特征。
接着siRNA通过结合一系列蛋白质而形成RISC来识别特异mRNA并最终将其降解。
图1RNAi作用机制示意简图
图2RNAi作用机制示意详细图
2.基因组DNA甲基化机制:
证据表明RNAi导致的染色质的结构改变[5]或使基因组上的基因甲基化可能是通过一类梳状蛋白实现的。
梳状蛋白通过调节染色质处于“开”或“关”的构象状态,从而产生稳定的可遗传的基因表达模式。
3.转译水平的基因沉默机制:
对线虫两个时序发育调控基因lin24和let27的研究为RNA及RNAi对基因表达的调控机制作了新的补充,表明stRNA对基因表达的调控是发生在翻译水平,而不是发生在转录或者转录后水平。
该发现大大拓宽了RNAi的应用,特别是siRNA和潜在的microRNAs的应用价值。
2.RNAi在病毒性疾病的防治方面的进展
尽管在哺乳动物中RNAi的作用没有在植物和无脊椎动物中重要,这方面研究还是取得了较大的进展。
迄今为止,不同的研究小组已成功的激活了针对不同复制策略的病毒RNAi通路,包括HIV、HBV/HCV、HPV、poliovirus、herpesVirus、HTLV-1、respiratorysyncytialvirus、EBV、SARS-COV等。
本文主要介绍RNA干扰在HIV-1、肝炎病毒和流感病毒方面治疗的研究进展。
2.1.RNAi与HIV-1
艾滋病的治疗一般以env编码的gp120和gp41作为靶点,但迄今为止还不能产生有效的抗体,近几十年主要采用高活性抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART),包含两种核苷酸逆转录酶抑制剂,何大一的鸡尾酒疗法采用了三种核苷酸逆转录酶抑制剂,在延长病人寿命方面取得了一定的成功,但仍存在无法完全治愈,价格昂贵,易产生耐药株等缺点。
目前艾滋病的治疗主要存在的困难在于HIV-1可减少MHC-1类分子的表达,env,gag等位点易突变以逃逸免疫反应,且不能确定诱导特异免疫反应的抗原。
而RNAi可能是最普遍的基因调节机制,是原始的“免疫系统”,通过RNAi技术沉默HIV病毒的RNA成了新的希望。
2.1.1.以HIV-1RNA基因组作为RNAi的靶点
在原病毒形成并转录后降解全部转录产物比较困难,且病毒核酸一旦进入蛋白衣壳RNA干扰就失去了作用,而HIV的RNA基因组进入逆转录复合体也会使问题复杂化,所以比较合理的进行RNA干扰的时期为病毒尚未整合前。
将siRNA转入细胞再感染HIV-1的多个实验已表明该法有很好的抑制复制的的作用。
在这些实验中,已被作为靶点的基因位点有env、gag、pol(结构基因),tat、rev(调节基因),nef、vif(附属基因),有报道称TIR结构域内的非翻译RNA序列也可以作为RNAi的靶点。
实验表明,细胞内源性的siRNA也可发挥RNAi的作用,而通过细胞内表达siRNA具有一定的优势,因为转染外源性的RNA需要长期提供siRNA以保证其长期活性。
还有实验证明长dsRNA(500-700nt)尽管对基因表达抑制作用不强,且可激活干扰素反应,但也可诱导序列特异性的RNAi。
但不管怎样,RNAi技术成功的关键在于其特异性,一个碱基的错配就可显著的降低其对病毒RNA的沉默作用,这就带来了HIV-1的高度变异性可逃脱siRNA的抗病毒作用的问题,因此只有以保守的RNA序列为靶目标才可减少siRNA耐受病毒的产生。
另外一个问题是并非所有的病毒RNA序列都对siRNA同样敏感,因为靶RNA中的一些序列可能包埋在二级结构或高度折叠的区域,或者与结合蛋白结合。
2.1.2.以细胞的HIV-1感染相关因子作为RNAi的靶点
如上所述,以病毒的RNA为靶点还存在许多问题,以HIV-1感染宿主细胞的病毒受体CD4或辅受体CCR5/CXCR4以及细胞内转录因子、集合因子为代表的HIV-1感染相关因子作为RNAi的靶点成了许多实验的方向。
有实验表明[6]针对CD4受体基因的特异性siRNA可使细胞表面的CD4降为原来的1/4,但它的应用存在两个问题,首先是细胞表面已有的CD4受体的降解需要时间,在此期间病毒的感染将继续进行,还有就是CD4在免疫系统功能的发挥上起着重要的作用,降低其表达可能带来很多并发的问题。
图3HIV-1生命周期中RNAi的靶位点
幸运的是CCR5(细胞趋化因子受体5)对人体正常生理功能的发挥并未发现有影响,尽管与直接以病毒RNA为靶目标相比,间接的沉默病毒受体在减少病毒产量的效率上有所降低,但它有其优点,首先大多数HIV-1毒株的侵染都需要CCR5作为受体,其次CCR5对人类非必需,实际上许多研究结果表明CCR5突变的纯合人类个体几乎可以完全抵抗HIV-1亲CCR5毒株的感染[7]。
DC-SIGN为不依赖于CD4和共受体的促进HIV-1感染的分子,不表达DC-SIGN的DC不能将感染的HIV-1递呈给T细胞,因此其基因也可作为一个靶点[8]。
转录因子NF-κB可和HIV-1的LTR结合调节转录延伸,其关键亚单位P65也可和TAR结合从而激活HIV-1转录的延长[9]。
但NF-κB也和CD4一样,对细胞免疫功能的调节有重要意义。
hRIP为Rev的细胞内共因子,是Rev辅助病毒RNAs正确定位于胞浆所必需的。
还有一些可能的位点,如人DHS、亲环素A、PARP-1等。
2.1.3.影响HIV-1对RNAi敏感性的因素
已有实验证实脊髓灰质炎病毒可逃脱体外siRNA的抑制作用[10].,所以现在公认的有前景的siRNA治疗的方法是对多个病毒功能必需靶点进行联合治疗。
病毒有多种逃脱机制,例如nef的突变可以导致RNA折叠的构象改变,从而导致RISC不能与nef的RNA结合。
再例如,一项实验表明[11]CD4特异的siRNA与CD8特异的siRNA竞争的沉默T细胞。
这说明RNAi机制是可饱和的,它将限制个体细胞中许多siRNA的使用。
研究还发现,在一些细胞(如巨噬细胞,树突状细胞)中HIV-1始终可以远离RNAi。
病毒群异质性(变异)可以阻止有效沉默。
逆转录复合体中,病毒RNA一些区域在RNP中与病毒蛋白紧密相连,使siRNA不易接近。
巨噬细胞中,病毒聚集于胞质MHCⅡ隔室内,在树突状细胞中,胞外病毒摄入后内化成小泡,这些都会形成长期的感染,是有效的RNAi必需解决的问题。
2.1.4.抗HIV-1基因疗法策略
siRNA表达呈递策略主要有两种,第一种为人工合成之后转染,该法现已广泛应用于各种细胞系和原代细胞,它具有作用稳定的特点,但这种直接转导入细胞的方法有点冒险。
第二种方法试图将RNAi与基因治疗相结合,以使机体可以稳定的产生内源性的siRNA或shRNA,该方法在HIV-1,HCV和HBV等病毒的实验中均被证明有效。
在具体应用中,一种普遍方法为将siRNA盒置于PolⅢ启动子的调控下(如U6或Hi启动子)其后siRNA可以shRNA形式表达。
或者可用不同启动子分别表达正义链和反义链,再形成双链RNA。
为便于将siRNA表达盒引入细胞,实验一般采用病毒载体,现已证明慢病毒载体表达的siRNA可使体外细胞及小鼠的大脑和肝脏内的外源基因或内源基因的表达减弱。
[12]
2.1.5.排除RNAi对细胞的负面影响
外源性siRNA可能会影响内源性的RNAi途径,从而扰乱细胞基因表达的正常调节。
siRNA还可与细胞的mRNA发生交叉沉默。
除此以外,这项新技术还有一些困难需要克服,其中最明显的一个是如何将得到的siRNA活性成分转入人类所有的细胞,现已有两种方法,一种是骨髓法,即用RNAi表达盒转导HIV感染个体骨髓中的造血干细胞,再将其转种回患者体内,这些干细胞就会增殖为能抵抗HIV-1感染的成熟T细胞。
经过病毒的选择,这些细胞会逐渐成为体内的优势群体[13]。
另一方案为利用肠道病毒和细菌,它们具有物质呈递的能力,因此可成为良好的载体。
2.1.6.问题和展望
虽然在体外siRNA显示了良好的抗HIV-1等病毒感染作用,是较有前途的基因治疗方法,但仍有许多问题需要解决:
(1)针对HIV-1变异,如何设
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