实时荧光定量pcr实验报告Word格式文档下载.docx

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　　应的横坐标。

　　Ct值与样品中模板的对应关系

　　Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

　　与终点法相比利用Ct值的优势

　　由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

　　此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。

因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

　　直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。

　　二．荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBRGreen法）

　　染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。

该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。

该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。

与EB的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结合并在497nm激发下。

　　染料法的优点：

1，无需设计、合成探针，实验成本低；

2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。

　　染料法的缺点：

1，由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。

因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；

2，由于SYBRGreen的上述特点，该方法不能应用于MultiplexQPCR技术。

（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）

　　探针法（以TaqMan探针为例）

　　探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：

在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。

目前市场上的探针主要种类有：

TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。

TaqMan探针的结构：

长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。

在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

　　TaqMan探针的性能：

在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。

　　TaqMan探针法工作原理：

　　?

变性（95°

C）：

模板dsDNA充分解链；

复性、延伸、酶切降解（60°

1，探针与靶序列结合；

上、下游引物与靶序列结合；

　　3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；

4，当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；

荧光信号的检测：

由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作

　　用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。

　　与染料法相比TaqMan探针法的优点：

1，实验的特异性得到了提高；

2，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行MultiplexQPCR。

　　与染料法相比TaqM

an探针法的缺点：

1，探针的使用提高了实验成本；

2，探针的使用需要设计及优化。

　　三．确定样品起始模板拷贝数的2类方法

　　绝对定量

　　采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。

　　标准品的种类：

含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。

标准品的定量：

UVA260、荧光分光光度检测等。

　　为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：

1，对各样品进行

　　细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；

2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。

相对定量

　　与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。

就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。

某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：

　　公式说明：

　　Rel.Quantity：

目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；

　　GOI：

目的基因（GeneofInterest）；

　　Norm：

内参基因（ReferenceGene，Normalizer，HouseKeepingGene）

　　Eff：

PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；

使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；

如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-ΔΔCt。

为什么需要设立内参基因？

　　如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：

1，样品处理时不同的纯化得率；

2，RT-PCR过程中不同的逆转录效率；

3，QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。

由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。

（注意：

内参基因的（1+EffΔCt）位于分母的位置，进行除法的运算。

）

如何选择内参基因？

符合什么标准的基因可以作为内参基因？

　　由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：

1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；

2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；

3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。

内参基因的ΔCt一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是一些管家基因，使用最多的为：

?

-actin、GAPDH、18sRNA等。

　　需要注意的是：

并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。

例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。

因此在选择内参基因时建议：

1，查阅相关文献；

2，设立多个内参基因；

3，采用表达谱的方法确定理想的内参基因。

采用Singleplex还是Multiplex？

篇二：

实时荧光定量PCR具体实验步骤

　　以下实验步骤仅供参考：

　　1样品RNA的抽提

　　①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

　　②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下1XXrpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

　　③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下1XXrpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

　　④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

　　⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

　　⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

　　2RNA质量检测

　　1）紫外吸收法测定

　　先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

　　①浓度测定

　　A260下读值为1表示40μgRNA/ml。

样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：

A260×

稀释倍数×

40μg/ml。

具体计算如下：

　　RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:

100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21

　　RNA浓度=0.21×

100×

40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl

　　取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：

　　35μl×

0.84μg/μl=29.4μg