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②组织化学法,如靛蓝染色法、红墨水染色法和软x射线造影法等。
③荧光分析法。
④离体胚测定法。
本节主要介绍四唑测定法、离体胚测定法、染料染色法和软x射线造影法。
Z—2生活力测定方法
一、测定原理
有生活力的种子,其活细胞原生质膜具有选择透性,当种子浸入染料后,染料大分子不能进入活细胞内,所以胚部等活组织不能被染料染色,而死的种胚细胞因原生质膜丧失选择吸收能力,故可被染料染色。
二、测定方法
(一)染色法
1.靛蓝染色法
此法适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。
所用试剂为靛蓝(或称靛蓝洋红),分子式为C18H8O2N2(SO5Na)2,系蓝色粉剂,能缓慢溶于水。
测定方法如下:
(l)种子预处理:
将种子浸人30℃水中,水稻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等种子须先去壳再浸种,浸种时间因种子不同而异,小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h,燕麦、芝麻等4h,油菜、花生、棉籽等6h,蓖麻、红麻、大麻等7h、黍8h、水稻12h、玉米20h将充分吸胀的种子(100粒2次重复),沿胚中线纵切(如禾谷类)或剥去种皮(如双子叶种子),以备染色用。
(2)靛蓝染色:
将处理好的种子置于培养皿或小烧杯内,加入靛蓝溶液淹没种子,纵切种子,用0.1%溶液,剥去种皮种子用0.2%溶液。
染色时间禾谷类为15min,油菜、芝麻、红麻和大麻等30min,大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60min豌豆180min
(3)观察鉴定:
取出染色后的种子,用清水冲洗后立即进行观察鉴定。
凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的,为有生活力种子;
凡种胚全部染成蓝色的,或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染成蓝色的,为无生活力种子。
2.红墨水染色法
其测定原理、种子预处理方法以及染色时间等与靛蓝染色法基本相同,只是所染成的颜色不同,死胚染成红色,活种子胚不染色。
测定时用刚开瓶的红墨水,加水稀释后使用,红墨水与水的比例:
小麦、玉米、大豆和棉花等为1:
60,大麦以1:
120为宜。
到达规定染色时间后取出种子,用清水冲洗并立即观察鉴定。
(二)其他方法
四唑测定法
(一)四唑测定法概述
1.发展简史
四唑测定法于1942年由德国H.Lakon教授发明,二战期间传入美国。
ISTA于1950年成立四唑测定技术委员会,1953年首次将四唑测定列入国际种子检验规程。
1974年,ISTA四唑测定技术委员会主席美国R.P.Moor教授,为发展和推进四唑测定技术的标准化,主持编写《四唑测定手册》,其后经过多次ISTA会议讨论修改,于I984年正式公布发行。
该手册汇集了世界上最先进实用的种子四唑测定技术,以及650多个属和种的农作物、蔬菜、林木、牧草、药材和花卉种子的具体测定技术,堪称最具权威性的四唑测定参考。
种子生活力四唑测定技术经过不断研究和完善,目前已在全世界广泛应用。
2.特点
四唑测定具有原理可靠、简便快速、结果准确、不受休眠限制以及成本低廉等特点。
该法比按细胞膜选择透比不同的染色方法更为可靠,所击仪器设备和物品较少,程序比较简单,一般24h之内即能获得测定结果,不论是休眠种子还是非休眠种子均适用。
因此,该法是世界公认的最有效的种子生活力测定方法。
3.适用范围
根据国际种子检验规程规定,四唑测定适用于下列范围:
(1)测定休眠种子、收获后需马上播种的种子以及发芽缓慢的种子的发芽潜力。
(2)测定发芽试验末期末发芽种子的生活力,特别是怀疑有休眠时。
(3)
测定种子收获或加工过程中的种子损伤(如热伤、机械损伤、化学伤害等)原因。
(4)解决发芽试验中遇到的问题,查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂、种子包衣等处理的伤害。
(5)查明种子贮藏期间劣变衰老程度,按染色图形分级,评定种子活力水平。
(6)调种时时间紧迫,快速测定种子生活力。
(二)四唑测定法的原理
有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应。
四唑溶液作为一种无色的指示剂,被种子活组织吸收后,参与活细胞的还原反应,从脱氢酶接受氢离子,在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲替。
化学反应式如下:
依据四唑染成的颜色和部位,即可区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。
一般来说,单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部分双子叶植物的胚乳、裸子植物种子的胚和配子体等属于活组织,含有脱氢酶,四唑渗入后能染成红色,而种皮和禾谷类胚乳等为死组织,不能染色。
除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外,还可能出现一些部分染色的种子。
判断种子有无生活力,主要看胚和(或)胚乳(或配子体)不染色坏死组织的部位及面积大小,而不一定在于颜色的深浅,颜色的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织区别出来,根据上述原理.鉴定种子胚的死亡部分,还可以查明种子死亡的原因。
四唑染色是一酶促反应.因此反应不仅受酶活性的影响,还受底物浓度、反应温度、pH等因素的影响。
该酶促反应的适宜pH为6.1~7,高于者低于此pH反应不能正常进行,也就无法测定种子活力的高低。
因此.对于游离酸含量高的四唑试剂应当用缓冲液配制。
反应速率随温度的不同而变化.温度每升高10℃反应速率提高1倍,譬如20℃'
时需要反应时间4h,30℃则需要2h,但反应最高温度不能超过45℃,染色时底物的浓度要一致,一般染色部位切开的种子,测定时四唑溶液的质量浓度为0.1%~0.2%,染色部位完整的种子,质量浓度为1%~2%。
种子预措时.采用的方法应根据种子的化学组成和种子结构确定。
(三)四唑测定法应用的化学试剂
1四唑
四盐类有多种,最常用的是2,3,5一氯化(或溴化)三苯基四氮唑,英文名为2,3,5-triphenyl
tetralium
chloride(orbromide)TTC(TTB)或TZ.分子式为C19H15N4Cl,相对分子量334.8亦称红四唑,为白色或淡黄色粉剂,溶点243℃,当达到约245℃就会分解,易溶于水,有微毒,试剂在光下会被还原成粉红色,因此需用棕色瓶盛装,且瓶外要裹一层黑纸。
同样.配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里,存放在暗处,种子染色也需在暗处和弱光处进行。
1996版《国际种子检验规程》规定,正常使用四唑溶液质量浓度为1.0%,但有些情况下,可使用较低或较高的浓度。
GB/T3543.7一1995规定,四唑染色通常使用质量浓度为0.1%~1.0%的四唑溶液,一般来说,切开胚的种子可用0.1~0.5%的四唑溶液;
整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用1.0的四唑溶液。
四唑溶液的pH要求在6.5~7.5范围之内,若溶液的pH不在此范围时,建议采用磷酸缓冲液来配制。
其配制方法为称取1g四唑粉剂溶解于100ml磷酸缓冲液中,即配成1.0%(或0.1%)的四唑溶液。
当用酸度计测定时,若四唑溶液的pH达不到要求,则可用NaOH
或NaHCO3稀溶液加以调节。
配好的四唑溶液应保存在棕色瓶中,一般有效期为几个月,如
存放在冰箱,则有效期更长。
已用过的四唑溶液不能再用。
2.磷酸缓冲液
为保证配制的四唑溶液pH在6.5~7.5范围内,通常采用磷酸缓冲液来溶解粉剂。
磷酸缓冲液的配制方法有两种,
(1)ISTA规程法:
先准备两种溶液。
溶液I——在1000ml蒸馏水中溶解9.078gKH2PO4。
溶液——在1000ml蒸馏水中溶解9.472gNa2HPO4或11.876gNa2HPO4·
2H2O
然后取溶液I2份和溶液II3份混合即成。
(2)AOSA规程法:
在1000ml蒸馏水中溶解5.45gNaH2PO4和3.79gNa2HPO4。
3.乳酸苯酚透明液
用于染色后的小粒豆类和牧草种子,使种皮、稃壳或胚乳变得透明,以便清楚地观察鉴定。
其配法为:
20ml乳酸+20ml苯酚+40ml甘油+20ml蒸馏水。
4.过氧化氢溶液
用于某些牧草种子(如黑麦草、早熟禾、羊茅和鸭茅等)的预湿浸种,以加快吸胀和酶的活化。
一般应用0.3%H2O溶液。
5.杀菌剂和抗生素
用微量的杀真菌剂和(或)抗生素加入四溶液或染色样品中,以延缓衰弱种子的劣变进程。
可应用0.5%青毒素等抗生素
6.胶液硬化剂
有些种子浸种后,种皮表面出现胶黏物质而变得非常光滑.难以进行样品准备,可用
AIK(SO4)212H2O,K2SO4,A12(SO4)3等硬化剂处理。
如将种子浸在1%~2%AIK(SO4)2·
12H2O溶液中5min,可有效地减少胶黏物质。
(四)四唑测定法的程序
参照1996版《国际种子检验规程》的规定.介绍四测定法的程序:
1.试验样品
从净度分析后并经充分混合的净种子中,随机数取100粒种子,4次重复。
如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力,则单用发芽试验末期所发现的休眠种子。
2.染色前的种子准备
(1)种子的预湿:
预湿是四唑测定的必要步骤。
因为吸胀种子一般比干种子不易破碎并且比较容易切开或刺穿。
此外,预湿使活组织酶系统活化,可提高染色的均匀度、深度、鉴定的可靠性和正确性。
有些种子在预湿前还要进行预措处理,以利吸胀,如水稻种子需脱去秤壳,豆科硬实种子需刺破种皮等,但须注意,预措不能损伤种子内部胚的主要构造。
如果利用较高或较低温度进行预湿,则相应调整预湿时间,并将所采用的时间和温度填报在种子检验证书上。
预湿方法有以下两种:
①缓慢预湿:
按发芽试验所用的方法,将种子放在纸上或纸间吸湿。
该法适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子,以及已经劣变的种子或过分干燥的种子。
有些种子,缓慢预湿达不到充分吸胀,有必要进一步在水中浸一段时间。
②水浸预湿:
将种子完全浸在水中,让其达到充分吸胀。
如果浸渍时间超过24h,则应换水。
部分植物种子在20℃下的预湿方式和最少预湿时间见表5一I,表5一2。
(2)染色前的种子处理:
许多植物的种类(表5一l,表5一2)在染色前需将其胚的主要构造和活的营养组织暴露出来,以利于四唑溶液渗透·
便于正确鉴定。
可采用下列处理技术刺穿、切开种子或剥去种皮。
其刺、切方法见图5一1。
处理后的种子应保持湿润.直到每个重复
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