基因工程复习资料Word下载.doc

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变性的DNA，降温时恢复为双链DNA的过程。

3、解链温度：

让DNA达到50%变性的温度。

4、复制子：

从复制起点开始复制出一个DNA分子或片段的核苷酸序列。

5、启动子：

不转录RNA，是RNA聚合酶的识别结合位点。

6、转录区：

能转录相应RNA，包括编码区和终止子。

7、操纵子：

原核生物中两个以上基共用一个启动子。

8、内含子：

真核生物转录区中的非编码间隔序列。

9、限制性核酸内切酶：

使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。

10、稀切酶：

有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶。

11、同裂酶：

不同的酶有相同的识别序列。

12、同尾酶：

切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。

13、黏性末端：

两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。

14、平末端：

两条链断开位置是平齐的，叫平末端。

15、位点偏爱：

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

16、酶活单位：

限制酶最适条件下60分钟切割1ugDNA所需的酶活性。

17、容积活性：

1ul酶活单位所具有的酶活性。

18、限制酶的star活性：

一些特定条件下，可以切断与原来识别序列不同的碱基序列，这个现象叫Star活性。

19、寡核苷酸连杆：

含限制酶识别序列的寡核苷酸序列。

20、衔接头：

含有一种以上限制酶识别序列，其一端或两端已具有酶切产生的粘末端。

21、DNA芯片：

DNA片段按事先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列。

22、DNA连接酶：

能催化双链DNA片段紧靠的3’和5’形成磷酸二酯键的酶。

23、DNA分子片段化：

用限制酶将DNA切割成可用于连接重组的片段的过程。

24、限制性图谱：

限制酶识别序列在DNA上的分布图。

二．DNA片段连接方式

（1）互补粘末端的DNA片段连接

（2）具平末端的DNA片段连接

（3）DNA片段修饰后连接

（4）DNA片段加连杆后连接

三、寡核苷酸的化学合成法

（1）磷酸二酯法

（2）磷酸三酯法

（3）固相亚磷酸三酯法

（4）DNA芯片法

种类：

引物、连杆、衔接头、DNA芯片

四、何谓PCR

原理：

以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性，引物与模板一侧复兴杂交，耐热DNA聚合酶催化引物延伸等过程多次循环，获得大量DNA的技术。

方法：

1、PCR管加入靶DNA

2、加入缓冲液和引物

3、加热至90-95℃

4、降温至37-60℃，加TaqDNA聚合酶

5、升温至70-75℃，延伸1min

6、循环25-40次，最后一次延伸5min

7、-20℃保存待用

五．DNA芯片原理

经过处理的载玻片上铺DNA连杆，连杆上用光照可除去的光敏基团保护羟基，用特制掩护摸保护不需合成基团，光照下，出现游离羟基，按设计在加上带光敏保护基团的核苷酸，然后加第二、三……个，直至形成探针。

探针与靶DNA结合发生强荧光，用激光共振显微镜激发检测。

第三章

1、cos位点：

进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。

2、cos细胞系：

非洲绿猿肾细胞系，经复制起始缺陷的SV40转化，产生能组成型表达SV40T抗原的细胞株。

3、cosmid克隆载体：

λ噬菌体衍生物，由质粒和含有cos位点的λDNA片段组装的一类新载体。

4、强启动子：

转录35sRNA的启动子。

5、微型染色体：

SV40（猴空泡病毒40）DNA与宿主组蛋白结合，形成的念珠状核小体。

6、早期转录区：

转录与感染相关的t抗原与T抗原基因。

7、晚期转录区：

转录壳蛋白（VP1，VP2，VP3）等。

8、SV40取代载体：

用外源DNA取代SV40DNA的晚期转录区或部分早期转录区，构建成相应的晚期或早期转录区取代型克隆载体。

9、微型病毒复制质粒克隆载体：

含SV40DNA复制起始位点，缺T抗原，只能转染cos细胞系和HFS细胞系。

10、整合平台：

受体细胞基因组上给定的外源DNA定位整合的区域。

11、定位整合克隆载体：

除一般质粒克隆载体必备元件，还含有1或2个与整合平台核苷酸序列同源的DNA片段。

12、基因打靶：

利用整合平台系统转基因的方法。

13、反义核酸技术：

与靶基因能互补的DNA、RNA片段，可以特异结合封闭靶基因。

二．λ噬菌体作为克隆载体的依据：

（1）λ噬菌体是一种温和噬菌体（安全）

（2）能承载较大外源DNA（大）

（3）λ噬菌体DNA有多种限制酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆。

（多）

构建策略和路线：

（1）切去λDNA非必须区和多余酶切位点

（2）在λDNA非必须区组入标记基因

（3）重组λDNA包装为颗粒，导入受体细胞

三．CaMV的阅读框和间隔区：

8个阅读框：

ORFI，ORFII，ORFIII，ORFIV，ORFV，ORFVI，ORFVII，ORFVIII

8个间隔区：

IR1，IR2，IR3

克隆位点：

ORFII，ORFVII

四．Ad（腺病毒）的特点：

（1）宿主广，易感染；

毒性低，安全

（2）可容纳外源DNA片段（2kb），且外源DNA不插入染色体

（3）Ad的DNA为线性DNA分子

应用价值：

（1）表达真核基因

（2）研究开发疫苗

（3）基因治疗癌症

五．定位整合载体的模式：

（1）内源平台双交换置换载体

（2）外源平台双交换置换载体

（3）内源平台双交换插入载体

（4）内源平台单交换插入载体

六．YAC（酵母人工染色体）特点：

可容纳1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

组成：

（1）含有质粒的ori，Apr和

（2）含酵母染色体的TEL（端粒）,ARS（染色体DNA复制起始位点）,CEN（着丝粒）,TRP（色氨酸缺陷）,URA（尿嘧啶缺陷）,Sup4

七．载体分类：

（1）质粒载体

（2）病毒或噬菌体载体

（3）染色体定位整合克隆载体

（4）人工染色体克隆载体

（5）特殊用途载体

特殊用途载体：

（1）组织特异性表达载体

（2）启动子探针载体

（3）串联启动子表达载体

（4）双启动子表达载体

（5）含增强子表达载体

（6）诱导表达载体

（7）反义表达载体

（8）分泌性表达载体

第四章

1、基因组文库：

某种生物基因组全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌群，这个群体叫基因组文库。

CDNA文库：

生物基因组mRNA逆转录产生的各种CDNA片段与载体重组，通过载体储存于受体菌群，这个菌群叫CDNA文库。

2、鸟枪法：

用多种内切酶使用基因组随机产生片段，并用产生的片段作为模板进行克隆的方法。

3、表达型CDNA文库：

目的基因表达为蛋白质，并用抗体筛选。

非表达型CDNA文库：

目的基因不表达为蛋白质，并用探针筛选。

4、表达序列标签（EST）：

能特异标记某个基因的序列，能显示该基因与其它基因的区别。

序列标签（ST）：

含有一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录的特异性。

5、表达图谱：

CDNA和基因序列在染色体上的定位分布图。

6、DNA标签法：

DNA插入植物基因内部或邻位通过突变形成新基因，插入的序列相当于在植物基因贴了一个标签。

若序列已知，可作为探针筛选目的基因。

7、RDA：

代表性差别分析，通过野生型与突变型基因组比较来分离鉴定突变基因的方法。

8、抑制PCR：

利用链内退火优于链间退火的特点,使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对,从而选择性抑制非目的基因片段的扩增.。

9、差别杂交：

通过制备两个不同群体的mRNA提取物，来筛选目的基因的一种技术。

二、制备目的基因的方法：

（1）直接分离法

（2）化学合成法

（3）PCR法

（4）构建基因文库法

直接分离法包括：

（1）物理化学法

（2）限制酶切法

（3）逆转录法

（4）双抗体免疫法

三．CDNA文库构建步骤：

（1）总mRNA的制备分离

（2）CDNA的合成

（3）双链CDNA的合成

（4）双链CDNA与载体重组

（5）重组载体导入宿主细胞

（6）筛选目的基因

四．从基因文库分离目的基因的方法：

（1）序列克隆法

（2）基因定位克隆法

（3）基因定位候选克隆法

（4）目的基因功能克隆法

（5）功能结合法

（6）染色体显微切割与微克隆法

（7）DNA插入诱变法

（8）差别杂交和减法杂交

（9）差示分析法

（10）根据生物大分子间相互作用分离

第五章

一．southern印记杂交，northern印迹杂交，斑点印迹杂交，菌落原位杂交比较

southern印记杂交：

是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至固相支持物，经固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

northern印迹杂交：

与Southern印记杂交相似，但主要检测RNA。

斑点印迹杂交：

在southern印记杂交基础上发展起来，将变性的DNA或RNA直接转移到杂交滤膜，然后用核酸探针分子杂交，以检测核酸样品中是否有特异的DNA或RNA。

菌落原位杂交：

将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。

将DNA烘干固定于膜上与探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

二．探针标记物种类：

（1）放射性标记物

（2）非放射性标记物：

生物素，地高辛，荧光素

受体要求：

（1）便于重组DNA导入

（2）使重组DNA稳定存在

（3）便于重组体筛选

（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵

（5）安全性高，易于扩大培养或发酵

（6）选用蛋白酶基因缺失或蛋白酶含量低的

（7）在遗传密码的应用上无明显偏倚

（8）具有较高加工机制，便于目的基因高效表达

（9）理论研究和生产实践上有较高应用价值

三．重组子筛选方法：

（1）电子显微镜作图法

（2）免疫化学法

（3）DNA序列测定法

（4）核酸分子杂交法

（5）转译筛选法

（6）转录产物作图

（7）表达产物分析法

（8）亚克隆法

（9）插入失活法

（10）重组子结构特征分析法

（11）遗传表达直接筛选法

第六章

1、基因沉默：

转基因动植物中外源基因不能正常表达的现象。

2、共抑制：

整合的外源基因沉默的同时，与其同源内源DNA的表达也受抑制。

3、启动子：

一段供RNA聚合酶识别结合的DNA序列。

4、增强子：

能增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。

5、终止子：

终止转录的DNA序列。

6、衰减子：

利用原核生物转录与翻译偶联的特性，依赖自身的特征序列和相应的RNA二