浅论hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究文档格式.docx
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成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。
【关键词】hVEGFA基因;
腺病毒载体;
转染;
缺血性脑血管疾病
[Abstract]Objective:
ToconstructtherecombinantadenovirusvectorcontaininghVEGFAgene.Methods:
ThehVEGFAgenecodingsequencewasclonedintopAdTrackCMVplasmidtogetpAdTrackCMVhVEGFA,whichwouldbetransformedintocompetent BJ5183carriedbackboneplasmidpAdeasy1already.ThehomologousrecombinantadenoviralplasmidwasdeliveredintoHEK293Acellsafterverification.Theidentifiedrecombinantadenovirus(rAdhVEGFA)wasamplifiedinHEK293Acells.ViralparticleconcentrationwasdeterminedbyTCID50.Results:
Therecombinantadenovirusvectorwasconstructedsuccessfully.TheexpressionofGFPwasobservedandtherightgenewasfound.Conclusion:
TherecombinantadenoviralvectorcarryinghVEGFAgenewassuccessfullyconstructed,andprovidedthebasisofischemiccerebrovasculardisease′sgenetherapy.
[Keywords]hVEGFAgene;
adenovirusvector;
transfection;
ischemiccerebrovasculardisease(ICVD)
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是Ferrara等在1989年从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化出来的一种具有肝素结合活性的生长因子,是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异性的有丝分裂原,能特异性地作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖[1]。
VEGF治疗缺血性脑损伤的研究具有重要的现实意义。
本实验利用重组腺病毒载体AdEasy系统构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA,以为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。
1材料与方法
材料和试剂
hVEGFA质粒由青岛海洋研究所惠赠。
TaKaRaTaqTM、pMDTM18T载体和T4DNA连接酶(TaKaRa公司);
穿梭质粒pAdtrackCMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy1、大肠埃希菌DH5α菌和BJ5183及HEK293A细胞由江苏大学医学技术研究所保存;
BglⅡ、XhoⅠ(TaKaRa公司);
PmeⅠ、PacⅠ(NEB公司),质粒大、小量制备试剂盒(AxyPrep公司);
Lipofectamin2000(Invirogen公司)。
方法
目的基因hVEGFA的克隆
上海生工生物技术有限公司合成引物,P1:
5′CGCAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCTTGG3′;
P2:
5′AAGCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACA3′。
以hVEGFA质粒为模板行PCR,退火温度为60℃,PCR产物于%琼脂糖凝胶中电泳,于长波紫外线透视仪下,切下大小为576bp的hVEGFA的cDNA条带,胶回收hVEGFA的cDNA片段。
用普通DNA聚合酶进行加碱基A尾延伸反应后,再用T4DNA连接酶将hVEGFAcDNA与pMDTM18T载体连接,将连接产物转化DH5α感受态细菌,涂在氨苄青霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB平板上,置37℃恒温箱培养过夜。
从每个培养皿上各挑取2个单克隆菌落分别接种于3ml含氨苄青霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB培养液中,置37℃恒温摇床(250r/min)培养过夜。
试剂盒提取质粒,同时送至上海生物工程公司测序分析。
从上、下游两端进行核苷酸全序列分析,其结果经生物信息学分析及BLAST软件分析,以验证重组质粒的正确性。
穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA的构建
将pMDTM18T载体hVEGFA用BglⅡ和XhoⅠ双酶切,酶切产物于%琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶回收试剂盒回收576bp的酶切产物,溶于蒸馏水备用。
同时将穿梭质粒pAdTrackCMV用BglⅡ和XhoⅠ双酶切,酶切产物于%琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶回收试剂盒回收10kb的酶切产物,溶于蒸馏水备用。
用T4DNA连接酶将以上获得的两个酶切产物进行连接反应。
将连接产物转化DH5α感受态细菌,涂在卡那霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB平板上37℃恒温箱培养过夜。
从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含卡那霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB培养液中,37℃恒温摇床(250r/min)培养过夜。
试剂盒提取质粒,BglⅡ、XhoⅠ双酶切鉴定阳性克隆,同时送至上海生物工程公司测序分析。
细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒
提取pAdTrackCMVhVEGFA质粒,取1μg用PmeⅠ线性化,37℃过夜。
胶回收线性化的质粒并转化到含有腺病毒骨架载体pAdeasy1的BJ5183感受态细菌中,在卡那霉素抗性的LB平板上培养16~24h,挑选较小的菌落培养,抽提质粒,琼脂糖凝胶电泳初筛重组体,再用PacⅠ酶切鉴定。
重组腺病毒的包装和扩增
鉴定正确的重组子转化到DH5α中后大量提取质粒,PacⅠ线性化pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA,乙醇、醋酸钠沉淀,用体积分数为的乙醇漂洗后,重新溶解在50μl灭菌的去离子水中。
配制A液(质粒DNA6μg,加无血清DMEM至250μl)和B液(14μlLipofectamin,加无血清DMEM稀释至250μl)。
A、B液混合,6h后换含血清的培养液,48~72h左右见病毒感染细胞漂起,约90%以上293A细胞出现细胞病理效应(cytopathiceffect,CPE),同时观测绿色荧光蛋白表达。
收集上层细胞加1ml无血清的DMEM,放-70℃/38℃反复冻融剧烈振荡3次,12000r/min离心10min,收集上清,再用同样的方法感染293A,以扩增腺病毒数量。
每培养瓶加病毒液,第1次感染用500μl,第2次感染用50μl,第3次感染用5μl。
制备的病毒液放于-70℃冻存备用。
病毒感染滴度测定
采用倍比稀释法在96孔板中计算病毒滴度。
按下列公式计算病毒滴度TCID50=101+d(),再根据公式T=a×
10bTCID50/ml=a×
/ml,将TCID50/ml换算成PFU/ml。
重组腺病毒的鉴定
取1μl病毒上清,加入5μl蛋白酶K,55℃反应1h后水浴煮沸5min。
取1μl所得产物,PCR扩增hVEGFA基因。
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
同样处理空载体病毒Adenovirusmock。
2结果
目的基因hVEGFA的克隆结果
从hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,见大小为576bp的hVEGFAcDNA条带(图1)。
M:
DL2000标准参照物;
V:
hVEGFA图1hVEGFA序列的克隆
穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA的构建和鉴定
用BglⅡ、XhoⅠ双酶切重组穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA,琼脂糖凝胶电泳,结果在750bp和500bp之间出现特异性条带(图2),与预期相符,初步证明VEGF基因正确构建到pAdTrackCMV中,构建的重组质粒命名为pAdTrackCMVhVEGFA。
将pAdTrackCMVhVEGFA交由上海生物工程公司测序分析,对外源插入片段从上、下游两端进行核苷酸全序列分析。
结果经生物信息学分析及BLAST软件分析,表明hVEGFA基因序列与基因库中报告一致,表明重组穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA构建成功。
Pt:
pAdTrackCMVhVEGFA图2BglⅡ/XhoⅠ双酶切鉴定重组腺病毒质粒
pAdTrackCMVhVEGFAFig2IdentificationofpAdTrackCMVhVEGFAwithBglⅡandXhoⅠrestriction
细菌内同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定
将上述穿梭质粒转入携带腺病毒骨架pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中,经卡那霉素抗性筛选,用PacⅠ酶切后可出现30kb的大片段条带和kb的特征性条带(图3),表明重组腺病毒载体pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA构建成功。
图3PacⅠ酶切鉴定pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA
重组腺病毒的包装扩增与病毒滴度
重组腺病毒DNA经线性化后转染293A细胞,在包装的第2、5、8、11天分别用倒置荧光显微镜观察,发现荧光逐渐增多,证实病毒包装成功(图4)。
将得到的病毒继续感染新的293A细胞,扩增病毒(图5)。
经过4轮扩增,最终病毒的滴度达到2×
1010PFU/ml。
图4转染后293A细胞绿色荧光蛋白的表达(×
200)图5重组腺病毒rAdhVEGFA的扩增(×
200)
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,可见如图1中一样、大小为576bp的hVEGFA的cDNA条带。
3讨论
缺血性脑血管疾病发病率有逐年增高趋势,死亡率高,患者即使存活,也会留有严重的后遗症
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- 浅论 hVEGFA 基因 重组 病毒 载体 构建 及其 转染 效率 研究