黄连上清片微生物检验方法验证方案.doc

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方案编号：

VOL-QWX-003版本号：

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黄连上清片微生物限度计数方法适用性

验证方案

方案编号：

VOL-QWX-003

年月

验证方案审批表

验证方案名称

黄连上清片微生物限度计数方法适用性验证方案

验证方案编号

VOL-QWX-003

方案起草人

起草日期

方案审核部门

审核人

审核日期

审核意见

化验室

质量部

批准意见

批准人

批准日期

执行日期

方案编号：

VOL-QWX-003版本号：

00第4页共13页

黄连上清片微生物限度计数方法适用性

验证方案目录

1.概述

2.目的

3.依据

4.范围

5.验证小组人员及职责

6.验证实施条件

7.合格标准

8.验证方法

9.验证结果

10.验证报告

1.概述

1.1样品资料

品名：

黄连上清片标准依据：

《中国药典》2015版四部通则

批号：

试验日期：

1.2处方：

黄连上清片为《中国药典》2015版一部中药成方制剂法定标准。

由黄连、栀子、连翘、炒蔓荆子、防风、荆芥穗、白芷、黄芩、菊花、薄荷、大黄、黄柏、桔梗、川芎、石膏、旋覆花、甘草组成。

辅料为糊精、淀粉、蔗糖、聚维酮K30、微粉硅胶、硬脂酸镁、薄膜包衣粉。

1.3功能主治：

散风清热、泻火止痛。

用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结，小便短赤。

1.4有效期：

18个月。

1.5依据《中国药典》2015版四部通则“非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”，根据剂型与产品处方判断，黄连上清片微生物限度检查内容包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数，控制菌检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌；拟采用“平皿法-培养基稀释法”进行微生物计数方法检查，采用“常规法”进行控制菌检查。

2.目的：

确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数和控制菌检查，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确性。

若检验程序或产品发生变化，可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

3.依据

《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——微生物计数法”

《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——控制菌检查法”

《中国药典》2015年版四部——“非无菌产品微生物限度标准”

4.范围：

本验证方案适用于？

？

制药有限公司黄连上清片微生物限度检查检验方法的适用性试验。

5.验证小组人员及职责

姓名

所在部门

职责

6.验证实施条件

6.1检验用水：

公司制备的经检验合格的纯化水。

6.2检验仪器设备：

验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，经过确认或再确认后合格。

所用检验设备如下：

SPX-250型生化培养箱

PYX-DHS-400型隔水式电热恒温培养箱

101-2型电热鼓风干燥箱

DHP-9272型恒温培养箱

DHP-9032型恒温培养箱

YX-400型医用双层普型不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器

DSX-280KB24立升手提式压力蒸汽灭菌器

GSP-9080型隔水式电热恒温培养箱

6.3验证培养基：

验证所使用的培养基经过培养基的适用性检查，结果符合药典要求。

所用培养基如下：

名称

来源

批号

胰酪大豆胨琼脂培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

麦康凯液体培养基

肠道增菌液体培养基

紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

麦康凯琼脂培养基

胰酪大豆胨液体培养基

6.4验证菌株：

名称

来源

批号

金黄色葡萄球菌菌株

枯草芽孢杆菌菌株

铜绿假单胞菌菌株

白色念珠菌菌株

乙型副伤寒沙门菌

黑曲霉菌菌株

大肠埃希菌菌株

7.合格标准

7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组不得检出试验菌。

8.验证方法

8.1菌液制备

所有使用的菌株均为西林瓶包装的定量菌株。

定量菌株适用于培养基适用性检查、控制菌检查、促生长试验、灵敏度检查等。

使用前将金黄色葡萄球菌株西林瓶、枯草芽孢杆菌株西林瓶、白色念珠菌株西林瓶、铜绿假单胞菌菌株、黑曲霉菌株西林瓶从冰箱中拿出平衡至室温，加入含有11ml无菌生理盐水的试管中，盖上瓶盖，静置约30s，震荡10s，吸取1ml加至适宜培养基中培养，即得含量为10～100cfu的菌落。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

8.2菌液的检验

8.2.1取上述金黄色葡萄球菌株、枯草芽孢杆菌株、大肠埃希菌菌株、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌菌株的稀释液各1ml，分别用45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30℃～35℃培养5天，计数，应为10～100cfu/ml，结果见表1。

8.2.2取上述白色念珠菌菌株、黑曲霉菌株的稀释液各1ml，分别用45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，20℃～25℃培养7天，计数，应为10～100cfu/ml，结果见表1。

8.3需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性试验

供试液制备：

取供试品10g，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成供试液，作为1：

10的供试液。

8.3.1平皿法：

结果见表2～8.

8.3.1.1试验组：

取供试液分别按1ml/皿加入平皿后，加入上述10～100cfu的试验菌，立即倾注至《中国药典》2015版规定的琼脂培养基中，置规定的温度培养3～5天，观察结果。

8.3.1.2菌液组：

除不加供试液外，同试验组测定方法。

8.3.1.3供试品对照组：

除不加菌液外，同试验组测定方法。

8.3.1.4将以上平皿需氧菌置30～35℃培养不超过5天，霉菌、酵母菌置20～25℃培养不超过7天，并在5天和7天分别进行计数。

8.3.1.5回收比值的计算：

试验组的菌落数—供试品对照组菌落数

—————————————————————————

菌液对照组菌落数

8.3.2培养基稀释法：

结果见表2～8。

8.3.2.1实验组：

取供试液分别按0.5ml/皿、0.2ml/皿加入平皿后，加入上述50～100cfu的试验菌，立即倾注2015版药典规定的琼脂培养基，置规定的温度培养3～5天，观察结果。

8.3.2.2菌液组：

除不加供试液外，同试验组测定方法。

8.3.2.3供试品对照组：

除不加菌液外，同试验组测定方法。

8.3.2.4将以上平皿需氧菌置30～35℃培养不超过5天，霉菌、酵母菌置20～25℃培养不超过7天，并在5天和7天分别进行计数。

8.3.2.5回收比值的计算：

试验组的菌落数—供试品对照组菌落数

—————————————————————————

菌液对照组菌落数

8.4控制菌检查方法适用性试验

8.4.1大肠埃希菌

供试液制备：

同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液制备。

8.4.1.1试验组：

取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述大肠埃希菌10～100cfu菌液，置30℃～35℃培养24小时后，取培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42℃～44℃培养24～48小时后，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

8.4.1.2阴性对照组：

以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.1.3阳性对照组：

以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，其他操作同试验组。

8.4.1.4供试品对照组：

取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.1.5实验结果：

见表9。

8.4.2耐胆盐革兰阴性菌

供试液制备：

取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml，制成1：

10的供试液在20℃～25℃培养2小时。

8.4.2.1定性试验试验组：

取上述供试液10ml，加置100ml肠道菌增菌液体培养基中，同时加入上述大肠埃希菌50～100cfu的试验菌，30℃～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30℃～35℃培养18～24小时，观察结果。

其它实验菌株同法操作。

8.4.2.2阴性对照组：

以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.2.3阳性对照组：

以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，其他操作同试验组。

8.4.2.4供试品对照组：

取供试液10ml加入100ml肠道菌增菌液体培养基中，除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.2.5同定性试验法做相当于0.1g、0.01g、0.001g的供试品定量试验。

若定性试验中，未检出耐胆盐革兰氏阴性菌，则不需要再进行定量试验。

8.4.2.6实验结果：

见表9。

8.4.3沙门菌

供试液制备：

取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml,混匀，30℃～35℃培养18～24小时。

8.4.3.1试验组：

取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，同时加入上述乙型副伤寒沙门菌50～100cfu的试验菌，30～350C培养24h后；取少量RV沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～350C培养48h后，观察结果。

其它实验菌株同法操作。

8.4.3.2阴性对照组：

以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.3.3阳性对照组：

以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，其他操作同试验组。

8.4.3.4供试品对照组：

取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml，混匀，

除不加菌液外，其他操作同试验组。

8.4.3.5实验结果：

见表9～10。

9.验证结果

表1、试验用菌液检查（菌落计数单位：

cfu）

试验

次数

计数

方法

大肠埃

希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢

杆菌

铜绿假

单胞菌

白色念珠菌

黑曲霉菌

乙型副伤寒沙门菌

1

平皿法

平均

2

平皿法

平均

3

平皿法

平均

表2、白色念珠菌计数方法的验证（菌落计数单位：

cfu，沙氏葡萄糖琼脂培养基）

方法

试验

次数

菌液组

试验组

供试品对照组

比值

菌落数

平均

菌落数

平均

菌落数

平均

平皿