南方医科大学微生物实验报告Word下载.doc
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1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯
2、脓汁标本1支,粪便标本1支;
伊红美兰平板2个,营养琼脂平板2个,伊红美蓝平板2个,接种环,酒精灯
3、斜面4支、细菌分离培养物(上次实验平板)
4、斜面培养物4支,营养肉汤4支,生理盐水2支,镜油瓶、拭镜纸1套,吸水纸1本,载玻片4张,染色瓶,染色架
5、斜面培养物4支,营养肉汤培养物(菌液)4支,半固体琼脂4支,营养琼脂平板4个,糖发酵管1套,抗菌素纸片1套,眼科镊子2把
6、半固体培养物4支,药敏试验培养物4个,微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤
1、培养基的制备:
培养基
称量干粉培养基(g)
水量(ml)
煮沸(次)
分装(ml)
备注
营养琼脂
11.4
300
3瓶,500ml瓶,平板
2.7
70
3
5
14支×
3,中试管,斜面
营养肉汤
1.3
60
1
20支×
2,小试管,肉汤
半固体琼脂
1.7
4
3,小试管,高层
(1)营养琼脂培养基的制备:
称量11.4g琼脂,置于三角烧瓶中,加入300ml蒸馏水,分2瓶装,用于倒平板。
(2)营养琼脂培养基的制备(用于制作斜面):
称量2.9g琼脂,置于三角烧瓶中,加入75ml蒸馏水,放在电炉上,先后煮沸3次,分15支中试管装,每支试管5ml。
(3)肉汤培养基的制备(用于制作液体培养基):
称量1.1g琼脂,置于三角烧瓶中,加入50ml蒸馏水,放在电炉上,煮沸1次,分15支小试管装,每支试管5ml。
(4)半固体琼脂培养基的制备:
称量1.7g琼脂,置于三角烧瓶中,加入60ml蒸馏水,放在电炉上,先后煮沸3次,分15支中试管装,每支试管4ml。
2、细菌的分离培养
平板划线分离法
甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色)乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色)
丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色)丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色)
步骤:
①接种环烧灼灭菌。
②取标本3~6ul。
③平板采光,当看到平板表面象镜面有反光的时候,保持这个角度,划线时就能看清划线痕迹,以便控制划线。
④接种环与平板呈30~40度角,在平板表面上方,以曲线的形式,作大幅度来回连续划线,边划边退,线段要划得长而密集,每区划线不少于30条。
⑤烧掉接种环上多余的标本。
⑥转动平板,通过第一区5~7次,使接种环重新沾上少量细菌,同样的方法划第二区。
⑦转动平板,接种环通过第二区1次,划第三区。
⑧转动平板,接种环通过第三区1次,划第四区。
⑨划第五区。
3、细菌的纯培养
斜面接种分工
甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面
丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面
方法:
接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后,伸入斜面底部,自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部,自下向上,作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记:
组号、颜色→收集平板-灭菌桶内(平板底部朝下,盖朝上放置)→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
4、细菌的形态学检查
涂片→干燥→固定→染色
(1)涂片→干燥→固定
甲→黄色,紫黑。
乙→白色,粉红。
丙→黄色,紫黑。
丁→白色,粉红。
涂片:
①接种环取盐水3ulX2滴,水滴间距小于2cm;
②取菌苔少许(1mm小菌落半个)与盐水混勻,涂成大于lcm2;
③涂毕→环移至涂膜中央侧立,待环内菌膜破裂,接种环烧灼灭菌。
→干燥→固定:
手持载玻片→端,涂膜朝上,两个涂膜快速通过火焰外层3次,时间2〜3秒钟。
(2)革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干,镜检。
油镜使用方法:
10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦,观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚(7:
3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。
5、液体培养基接种(肉汤接种)
甲→金黄色,乙→白色,
丙→紫黑,丁→粉红。
(1)接种环斜面取菌,在靠近液面的管壁上,上下研磨接种;
(2)在管壁上,将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环,烧灼灭菌;
(3)标记:
组号,颜色
6、细菌的生化试验等
(1)细菌的糖发酵实验:
①在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中,并做好标记
②在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中,并做好标记
③在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中,并做好标记
④在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中,并做好标记
①用砂轮在糖发酵管液面上方2~3cm处,切割一道切痕。
②两手握住发酵管将管子折断。
管口烧灼灭菌。
③接种针斜面取菌,伸入培养基内,在管壁上,上下研磨接种。
退出接种针,烧灼灭菌。
④管口朝向相同,放置在平皿内。
(2)抗菌素敏感性试验
纸片扩散法
甲→黄色菌液乙→白色菌液
丙→紫黑菌液丁→粉红菌液
①先取→环菌液;
②沿平板直径拉一条细菌接种线;
③再取一环菌液;
④旋转平板90度角,拉另一条接种线,使两条细菌接种线呈“十字形”;
⑤然后在平板上半部,作连续来回密集划线,每次划二分之一平板;
⑥旋转平板90度角,二次密集划线;
⑦旋转平板90度角,三次密集划线;
⑧旋转平板90度角,四次密集划线;
⑨设三点,呈等边三角距离;
⑩点距离平板边缘约15mm;
⑪作标记:
青、先、庆;
⑫镊子尖嘴朝下,夹取相应药物纸片的边缘,平贴在已设定的位置上,轻轻按压纸片。
(3)血浆凝固酶试验
①取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约2~3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8~10mm的一层薄菌膜。
③立即观察结果。
(4)半固体穿刺接种法
①用接种针取紫黑色菌落垂直刺入半固体培养基,再按原路返回,并做好标记
②用接种针取粉红色菌落垂直刺入半固体培养基,再按原路返回,并做好标记
①接种针斜面取菌,从半固体中心,垂直刺入,到达培养基底部5分之4处,再循原来的路线,退出接种针。
②管口、接种针经火焰烧灼灭菌③37℃下培养18~24小时。
7、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
①取洁净的载玻片一张,将磨面近端设为对照区,滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区,滴加福氏志贺菌诊断血清15ul,
②用接种环分别取粉红色菌苔,约2个小菌落的菌量,研磨于盐水或血清内,混合均匀。
③载玻片来回倾侧,让菌液充分混匀,凝集速度更快、结果更清楚。
④观察记录结果:
菌液凝集者记为阳性,菌液均匀混浊记为阴性。
四、结果与讨论
(一)实验结果
1.洗手前后对比
图片分析:
洗手图不是很理想,上面同学的洗手后与消毒后与预期的不一致,可能是操作不当引起的。
2.细菌的分离培养结果:
(1)脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落,菌落的色素是脂溶性的,是细菌本身的颜色。
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。
(2)粪便标本在伊红美蓝平板上,有紫黑色、淡粉红色两种菌落,菌落色素是水溶性的,不是细菌本身的颜色,紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落,菌落直径2〜3mm;
粉红色菌落淡粉红色,半透明,直径1〜2mm.
图片分析:
由于同学都是第一次划线,所以划线都不是很好。
3.细菌的纯培养:
在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本,从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面,菌苔的颜色,还是原来菌落的颜色,黄色或白色。
从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面,菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明,后者透明。
中间两组效果不好,可能来自于采菌过少或者划线操作不当
4.细菌的形态学检查:
脓汁标本(左边为白色菌苔,右图为金黄色菌苔)
粪便标本(左图为粉红菌苔,右图为紫黑色菌苔)
镜下观察:
用普通平板,从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落,这两株细菌,显微镜油镜下均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状,是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素,这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
显微镜下,均为G-杆菌,散在排列,从形态上不能鉴别是什么细菌。
6.细菌的生化试验等:
(1)半固体穿刺接种法
实验效果与预期一致,但是拍摄效果不是很好。
四组的半固体培养接种的培养图,由于拍摄效果不好,但是依然可以分辨生长的情况。
直线生长的表明无鞭毛。
(2)细菌的糖发酵试验
糖发酵实验结果图.从下至上分别为:
(④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖)
编号
菌苔
糖发酵管
反应现象
结果描述
符号
甲
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
乙
丙
粉红
糖发酵管变黄色无气泡
分解X糖产酸不产气
+
丁
④
糖发酵管变紫色无气泡
-
+:
产酸或阳性⊕:
产酸产气-:
阴性
紫黑细菌微型发酵关内液体变黄,产生气泡,气泡的高度分别为10mm和17mm,说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖,产酸产气;
粉红细菌只分解葡萄糖,不产气,不分解乳糖。
(3)抗菌素敏感试验结果:
.3号同学划线最好,本人4号划线不好,还是没有划好。
2号同学效果不好,可能取菌过少。
4:
浓汁标本中白色菌落3:
浓汁标本中金黄色菌落
2:
粪便标本中粉色菌落1:
粪便标本中紫黑色菌落
药敏试验结果分析
青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色+++
白色+±
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