第十六章DNA的复制与修复_精品文档文档格式.doc
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起点的结构是很保守的。
(二)复制终止点:
已发现Ecoli的与复制终止有关位点,其中含有23bp的保守序列,由tus蛋白与此位点结合参与复制的终止。
真核生物中似乎没有复制终止点。
(三)复制多数是双向、对称的,但也有例外。
通过放射自显影可以判断复制是双向还是单向:
先在低放射性培养基中起始复制,再转移到高放射性培养基中,如是双向复制,其放射自显影图是中间银密度低;
单向复制则为一端低。
(四)单向复制有一些特殊方式:
1.滚动环:
噬菌体φX174DNA是环状单链分子,复制时先形成双链,再将正链切开,将5’连接在细胞膜上,从3’延长,滚动合成出新的正链。
2.取代环:
线粒体DNA复制时是高度不对称的,一条链先复制,另一条链保持单链而被取代,呈D环形状。
这是因为两条链的复制起点不同,另一条链的起点露出才能复制。
三、有关的酶
(一)反应特点:
1.以四种dNTP为底物
2.需要模板指导
3.需要有引物3’-羟基存在
4.DNA链的生长方向是5’-3’
5.产物DNA的性质与模板相同
(二)大肠杆菌DNA聚合酶
1.DNA聚合酶I:
单链球状蛋白,含锌。
有聚合酶活性和外切酶活性,其中3’-5’外切酶活性起校正作用,5'-3'活性起修复和切除引物作用。
DNA聚合酶I主要起损伤修复作用。
每秒可聚合10个碱基。
切除氨基端5'-3'外切酶活性后称为Klenowfragment,用于引物标记等。
2.DNA聚合酶II:
单链,以切口双链DNA为模板,作用不清楚。
3.DNA聚合酶III:
起DNA复制作用,功能与聚合酶I相似。
全酶共10种亚基,含锌。
每秒可聚合1000个碱基。
(三)真核生物DNA聚合酶:
有a、b、g、δ、ε五种,性质与大肠杆菌的酶相似,多无外切酶活性。
a相当于聚合酶III,用于引发、滞后链合成;
b主要起修复作用,γ位于线粒体,δ合成前导链,但前50个碱基由a合成。
(四)DNA连接酶:
使双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。
需供能,细菌用NAD,动物和噬菌体用ATP,形成焦磷酸键的活化形式,再由3’羟基发动亲核攻击,形成磷酸二酯键。
大肠杆菌的连接酶作用于粘末端,T4的还可作用于平末端。
四、半不连续复制
(semi-discontinuocosreplication)
(一)复制叉由5’向3’方向连续复制,称为前导链;
另一条链复制叉由3’向5’移动,而DNA复制方向不变,形成许多不连续片段,称为冈崎片段,最后连接成完整的DNA,称为滞后链。
(二)首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10个核苷酸以内的RNA引物,然后聚合酶III在引物3’-羟基上合成DNA,再由聚合酶I切除引物,填补空白,最后DNA连接酶将冈崎片段连接起来,形成完整DNA。
(三)复制具有高度忠实性,其错配几率约为10-10,从热力学上考虑,碱基发生错配的几率约为10-2,酶对底物的选择作用和校正作用各使错配几率下降10-2,所以体外合成DNA的错配几率为10-6。
体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性,修复系统对错配加以纠正,进一步提高了复制的忠实性。
五、解链
复制时必需解链,如靠旋转,则大肠杆菌DNA要达到每分钟6000转。
其实复制时是用拓扑异构酶和解螺旋酶来解链的。
拓扑异构酶I可切断一条链,牵引另一条链通过切口,再连接起来。
每次可消除一个负超螺旋,不需要ATP。
同转录有关。
拓扑异构酶II每次引入2个负超螺旋,需要ATP。
引入负超螺旋可消除复制叉前进带来的张力,促进解链。
解螺旋酶通过水解ATP来解开双链,每对碱基需2个ATP。
单链结合蛋白(SSB)可与解开的单链结合,防止复性和水解。
六、DNA复制体的结构
七、与DNA复制有关的酶和蛋白质因子由30多种,他们在复制叉上形成离散的复合物,彼此配合,进行高度精确的复制,这种结构称为复制体。
引物合成酶与另外6种蛋白构成引发体。
在DNA复制叉上进行的基本活动包括:
(一)双链的解开
(二)RNA引物的合成
(三)DNA链的延长
(四)切除引物,填补缺口,连接相邻的DNA片断
(五)切除和修复尿嘧啶和错配碱基。
八、真核生物DNA的复制
(一)真核生物有核小体结构,复制速度慢,复制叉每分钟移动约1000-3000碱基对,而细菌约为50千碱基对。
真核生物有许多复制起点,复制子只有细菌的几十分之一,所以复制时间在同一数量级(E.coli4.2Mb,酵母、果蝇40Kb,植物300,蛙200,鼠150Kb)。
快速生长的原核生物,其复制起点可连续复制,而真核生物采取多复制起点的方法加速复制。
(二)真核生物复制时,核小体打开,组蛋白直接转移到子代前导链上,滞后链用新合成的组蛋白。
所以DNA是半保留的,而组蛋白是全保留的。
真核生物冈崎片段长度约为200碱基对(E.coli1-2Kb),相当于一个核小体的长度。
(三)真核生物的增殖周期可分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)等四个时相,间期为分裂期作准备,进行生物大分子和细胞器的倍增。
前期合成DNA复制必须的蛋白质和RNA,复制期先复制常染色质DNA,再复制异染色质。
然后进入有丝分裂的准备期。
前期变动较大。
分裂期后,有些细胞进入前期,开始下一个周期;
有些失去分裂能力;
有些脱离分裂周期,或进行分化,或进入静止期(G0期)。
成年动物大部分细胞处于静止期。
九、DNA复制的调控
复制有复杂的调控机制。
有正调节,也有负调节。
有顺式作用,即以某DNA序列为调控因子;
也有反式作用,即以基因的产物,如蛋白质或RNA为调控因子。
原核生物的复制起点与细胞膜相结合,复制与细胞膜有密切关系。
真核生物复制从核膜开始,与质膜也密切相关。
dnaA浓度决定起始频率。
第二节DNA的修复
一、DNA的损伤
(一)环境作用
1.物理因素
²
紫外线:
形成嘧啶二聚体,使转录终止,复制受阻。
电离辐射:
αβγX-射线等,主要通过电离作用造成损伤。
可造成多种损伤,如DNA断裂、碱基脱落、杂环破裂、氧化等。
2.化学因素
烷化剂:
有活泼烷基,可转移到碱基或磷酸上,如硫酸二甲酯、芥子气等。
鸟嘌呤的O6和N7最易烷化,导致错配(GT)或脱落。
磷酸三酯不稳定,易断裂。
双功能试剂可造成交联。
碱基或核苷类似物:
FU、BrdU、6-巯基嘌呤等。
可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配。
亚硝酸盐及亚硝胺:
前者造成脱氨,后者氧化后生成烷化剂和自由基。
代谢活化化合物:
如苯并笓、黄曲霉毒素等。
经混合功能氧化酶催化形成环氧化物,与核酸结合,造成突变。
以上物理及化学因素统称诱变剂。
3.生物因素
DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组,引起突变。
(二)自发性损伤
1.复制时的碱基错配
2.互变异构:
A=NH时可形成A=C,G-OH时可形成GT三键配对
3.碱基脱氨:
C-U,A-I,G-X
4.碱基丢失:
大肠杆菌每代丢失一个嘌呤,哺乳动物可达一万个。
嘧啶丢失几率只有嘌呤的1/20。
二、光复活
光复活酶可被可见光(300-600纳米,400纳米最有效)激活,分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。
此酶广泛存在,但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞,且是次要修复方式。
三、切除修复
(一)细胞内有多种特异的核酸内切酶,可识别DNA的损伤部位,在其附近将DNA单链切开,再由外切酶将损伤链切除,由聚合酶以完整链为模板进行修复合成,最后有连接酶封口。
(二)碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N-糖苷酶切除,然后用AP(apurinic/apyrimidinic,缺嘌呤或缺嘧啶)核酸内切酶打开磷酸二酯键,进行切除修复。
DNA合成时消耗NADPH合成胸腺嘧啶,可与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶相区别,提高复制的忠实性。
RNA是不修复的,所以采用“廉价”的尿嘧啶。
(三)切除修复不需光照,也称暗修复。
大肠杆菌中有UvrABC系统,可切除修复嘧啶二聚体。
人体缺乏相应系统则发生“着色性干皮病”,皮肤干燥,有色素沉着,易患皮肤癌。
可加入T4内切酶治疗。
四、重组修复
以上修复发生在复制前,称为复制前修复。
复制时未修复的损伤部分会留下缺口,通过遗传重组进行修复:
从完整的母链上将相应序列移至缺口处,用再合成的序列填补母链的空缺。
此过程也叫复制后修复。
重组修复中原损伤没有除去,但若干代后可逐渐稀释,消除其影响。
所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶,如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等。
五、诱导修复
DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应,包括修复效应、诱变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。
细胞癌变也可能与应急反应有关。
应急反应诱导切除和重组修复酶系,还诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶,加快修复,避免死亡,但提高了变异率。
单链DNA诱导重组蛋白A,可水解LexA蛋白,使一系列基因得到表达,如RecA、UvrABC、SOS修复所需的酶等,产生应急反应。
应急反应可作为致癌物的简易检测方法。
采用缺乏修复系统、膜透性高的E.coli突变株,并添加鼠肝匀浆液。
六、Ada蛋白
也叫适应性蛋白,可识别甲基化的DNA,将甲基转移到自身的半胱氨酸上,不可逆,故称“自杀修复”。
可修复磷酸及鸟苷上的甲基。
七、真核细胞修复特点
1.多聚腺苷酸-核糖化:
由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化,用NAD合成并转移到相应蛋白上。
可增加一些修复酶的活性,如连接酶。
2.转录-修复偶联:
转录时,若模板链损伤,则转录暂停,转录因子TFIIS使聚合酶退回,CSA/CSB及TFIIE召集修复。
若DNA双链损伤,则模板链优先修复。
第三节逆转录生成DNA
一、逆转录酶
含两个亚基,a亚基是b亚基水解产生的。
含锌。
要求有模板和不少于四个核苷酸的引物,由5’向3’合成DNA。
真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作为模板。
此酶有多种功能,可先合成DNA-RNA杂合分子,再水解RNA(RNA酶H活力),然后复制其互补链,形成双链DNA。
二、逆转录过程
以前任宿主的tRNA为引物,为复制末端,需要借助末端重复结构进行“跳跃”。
三、意义
(一)逆转录与细胞恶性转化有关,为肿瘤的研究和防治提供了重要线索。
艾滋病、乙肝等也有逆转录过程。
(二)逆转录病毒经过改造,可作为信息载体,用于肿瘤和遗传疾病的基因治疗。
真核生物的基因组中多含逆假基因,可能是信使RNA经逆转录而整合到基因组中的。
所以真核生物正常细胞也存在逆转录过程
本章名词解释
半保留复制(semiconservativereplication):
DNA复制的一种方式。
每条链都可用作合成互补链的模板,合成出两分子的双链DNA,每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。
复制叉(replicat
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- 第十六 DNA 复制 修复 精品 文档
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