免疫共沉淀原理及实验方法_精品文档Word文件下载.doc
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IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"
特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。
为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。
欲速则不达,确定好比例很必要。
(待续)
二准备:
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量kit
#SDS电泳试剂
#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)
#PBS
#NaN3
#proteinAsapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA缓冲液(最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)
5MNacl15ml(150mM)
0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)
20%TritonX-10025ml(1%)
10%DOC50ml(1%)
10%SDS5ml(o.1%)
TLCK18.5mg(0.1mM)
TPCK35mg(0.2mM)
DDW395ml
toal500ml
另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。
注意不易溶于水)
2.NP40lysis缓冲液
20%NP4025ml(1%)
DDW450ml
使用前加1mM的PMSF
注意点:
*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC<
SDS是离子性的强活性剂。
注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。
1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。
*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。
根据自己需要调节。
EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1调制proteinAsapharose
proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存
用单抗做一抗时,把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。
旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s
去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。
避免长期保存。
2.抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。
加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。
RIPA的量:
6cm的培养皿加1ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。
30m,15000rpm离心,上清转移到新tube。
不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h
加proteinAsapharose50ul,再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。
往sapharose加RIPA,vortex混匀,离心,去上清。
重复4次洗净。
加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。
3.注意点
A:
不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。
对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。
B:
对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。
(完)
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免疫共沉淀原理及实验方法
[SPANclass=javaid=text9766]免疫共沉淀[BR]一原理:
[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"
[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。
[BR][BR]其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
[BR][BR]再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
[BR][BR]每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。
(待续)[BR]二准备:
[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinAsapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液(最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)[BR]5MNacl15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%TritonX-10025ml(1%)[BR]10%DOC50ml(1%)[BR]10%SDS5ml(o.1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW395ml[BR]toal500ml[BR]另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。
注意不易溶于水)[BR]2.NP40lysis缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)[BR]5MNacl15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%NP4025ml(1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW450ml[BR]toal500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点:
[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。
[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。
[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC&lt;
[BR]*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。
[BR]Protocol[BR][BR]1调制proteinAsapharose[BR][BR]proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时,把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。
旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s[BR][BR]去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。
[BR][BR]2.抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。
[BR][BR]30m,15000rpm离心,上清转移到新tube。
不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加proteinAsapharose50ul,再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。
[BR][BR]加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。
[BR][BR]3.注意点[BR]A:
[BR]B:
(完)[/SPA
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